食品中偶氮类合成色素的检测方法研究进展

王兴等

摘 要：食品在加工的过程中容易丢失原本的颜色，食品加工者为了使食物看起来更美味，向其中添加廉价的合成色素。而在许多国家因该色素可能存在对人体的危害，禁止在食品中添加偶氮类合成色素，并严格监管该类食品在国内的流通及进出口，监管部门采用高灵敏度和高选择性的分析方法进行监测，以确保食品的质量安全。本文将介绍食品行业中对于添加偶氮类合成色素的各种分析技术，并对不同的提取方法做了简要的描述。

关键词：偶氮 色素 固相萃取 高效液相色谱 酶联免疫

1 简介

偶氮类合成色素，被广泛的应用在食品、药品和化妆品等领域，其种类有很多，熟知的有苏丹红、柠檬黄、日落黄、胭脂红等，而这些物质在体内可被还原为芳香胺类物质，从而对DNA造成氧化损伤[1]；同时色素在制作的过程中难免掺杂有砷、铅、镉、苯酚等杂质。目前已有不少研究发现了偶氮类色素的毒性作用，如使肝细胞生长异常[2]，影响酯酶同工酶的表达[3]以及致突变作用[4]等，因此多数偶氮色素已被禁止添加到食物中。我国2014年最新颁布的《食品添加剂使用标准（GB2760-2014）》中对允许使用的柠檬黄、胭脂红等11种偶氮类色素在食品中的限量及使用范围做了明确的规定，严禁超量或超范围添加。

2005年3月4日，北京检出亨氏某批号的辣椒酱中含有苏丹红I。同年，著名连锁快餐品牌肯德基的调味料中检出苏丹红I，该调味料曾被使用在多种产品上，不久，这些产品在国内所有肯德基餐厅内全部停售，并全部销毁。2012年，有关部门发现红牛饮料配料中含有国家不允许在该饮料中使用的偶氮类合成色素胭脂红。

2015年，山东省针对零食的专项抽检，发现多数不合格食品检出含有柠檬黄、日落黄等合成色素。山西省发布的食品安全监督抽检公告显示，在糕点及熟肉制品等中检出违规使用的日落黄、柠檬黄、胭脂红。国家食药监总局在抽检调味品时发现，江苏一家公司生产的红烧酱汁检出的柠檬黄和日落黄含量均超出限定标准约3倍。

近几年来，各省市的食药监管部门以及国家食药监总局在对市面销售的食品进行抽检的过程中发现，偶氮色素滥用现象仍十分严重，甚至有一些不法商贩将廉价购买的病死猪肉、老鼠肉等未经检验检疫的劣质肉，通过添加明胶、胭脂红、亚硝酸盐等手段冒充新鲜肉贩卖。

2 分析方法

2.1 样品的前处理

可应用于提取食品中合成色素的方法有很多，如滤膜法、固相萃取法（SPE）、液相萃取法（LLE）、微波辅助萃取法（MAE）、超声辅助萃取法（UAE）等，但目前没有一种可以通用的前处理方法，因此针对不同样品还需要选择不同的提取方法。

液体食品中，含乳饮料经离心沉淀除掉蛋白质，碳酸饮料经加热超声除去二氧化碳，酒类食品加热除去乙醇，之后再用柠檬酸溶液调pH到6左右，经滤膜过滤后待测。

肉制品首先要将样品粉碎并混合均匀，经石油醚除去肉中的脂肪，再用乙醇-水-氨水溶液（75：24：1，v/v/v）反复提取色素，水浴除去乙醇和氨水，样品溶液采用聚酰胺吸附后，将提取液浓缩后调节pH值，再定容至一定体积，经滤膜过滤后待测。

糕点类食品可利用乙醇氨溶液作为提取剂，超声提取试样溶液，经甲醇溶液洗涤，聚酰胺柱吸附后，收集溶液，调节pH值，经滤膜过滤后待测。

2.2 检测食品中的偶氮类色素

2.2.1 分光光度法

食用合成色素在可见光区具有高度的吸光性，同时由于该方法成本低，对操作者要求低，因此分光光度法是一种理想的定量分析方法。然而，含混合色素的溶液缺乏特异性可见吸收峰阻碍了这一技术的发展，主要是多种偶氮染料混合时吸收波长发生重叠。

Soylak等应用MCI GEL CHP20P作为填料的固相萃取技术处理食品样品，提高了分光光度法测定水样中诱惑红的灵敏度。Kaur在2012年对使用导数分光光度法配合H点标准加入法（HPSAM）以及浊点萃取法（CPE）测定食品中的合成色素及其铝色淀的研究现状做了综述。Turak等人利用四阶导数分光光度法测定了饮料中的诱惑红和胭脂红，方法简单、快速、适用性广。

2.2.2 薄层液相色谱法（TLC）

薄层液相色谱法是最简单、经济和最合适的定量分析色谱技术，该方法总体检测时间小于30min，适用于色素的现场快速检测，但其干扰较大，仅能用于初步判断，不能准确定性定量。

Kucharska等对使用TLC技术检测不同食品中各种色素的前处理方法和色谱条件做了综述。de Andrade等以异丙醇和氨水混合作为流动相洗脱液，利用固相萃取及TLC技术成功检测出了无醇饮料中的合成色素。

2.2.3 毛细管电泳法（CE）

该方法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为动力，依据样品中各组分之间淌度和分配上的差异而实现分离样品的电泳分离分析方法。毛细管电泳法有多种分离模式，如毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱（MEKC），毛细管等速电泳等。

已经有很多利用CE分析食品中合成色素的方法被媒体报道，如1995年Thompson等通过胶束电动毛细管色谱法来测定糖果和甜酒中使用的10种常用偶氮类合成色素；Huang等通过微乳液电动色谱法（MEEKC）成功检测了食品中的8种合成色素；Prado等使用CE-UV/vi分析了酒精饮料中的11种色素；Del Giovine等使用CE-PDA的方法对冰淇淋中的日落黄、酸性红和胭脂红含量估值。

2.2.4 高效液相色谱法（HPLC）

液相色谱法是根据保留时间以及峰面积来进行定性、定量的方法，具有分离效能好、检测灵敏度高、应用范围广等特点，因此被广泛应用于检测食品中添加的各种色素，并且常常与UV-Vis、PDA或MS等检测技术联用，但该方法的样品前处理比较繁琐，所需仪器设备昂贵，且检测所需时间长，从而不便于现场快速检测。

液相色谱法中最常用的方式是反相液相色谱，其中固定相是相对非极性的，而流动相是极性的。Bonan等人[5]以C8为固定相的梯度洗脱模式同时检测固体食品和饮料中的多种食用色素。Dossi等使用梯度反相色谱技术利用较少的样品同时检测了多种食品添加剂。Gennaro通过离子交换液相色谱测定了糖果中的红色染料。Jurcovan等使用水和乙腈作为流动相，同时测定无醇饮料中的诱惑红和胭脂红。Culzoni等使用RP-UFLC-PDA快速分析液体食品中的20种食用色素。Al-Degs[6]采用混合线性分析法（HLA/GO）定量分析了无醇饮料中的诱惑红、日落黄和柠檬黄，结果表明HLA/GO技术检测无醇饮料中的合成色素比HPLC更加简单、快速。

调查发现，大多数液相色谱法会使用有机溶剂作为流动相，这将对人类的健康和生存环境造成消极的影响，因此，开发一种绿色且简单高效的分析方法显得尤为重要。其中，tritonX-100（一种表面活性剂）作为流动相就是一项新的改进。

2.2.5 液谱-质谱联用法（LC-MS）

由于许多合成色素的光谱非常相似，有时使用普通的PDA或UV-Vis检测食品中的混合合成色素显得尤为困难。因此，许多研究人员使用质谱检测器来辅助识别样品中的合成色素。质谱技术不依赖光谱，不仅可以提高灵敏度，同样也可以使用串联质谱技术（MS/MS）检测样品的分子量、裂解模式等结构信息。

Ma等通过LC-PDA-MS同时测定饮料和调味料中的脂溶性与水溶性合成色素。Gosetti等的研究使用HPLC-MS证明日晒会降低饮料中日落黄的含量是由于日落黄被降解为5-氨基-6-萘酚-2-磺酸。最近，Zou[7]等使用醋酸铵、乙腈洗脱液提高了ESI负离子模式对食品中7种合成色素的电离效率。Chen等采用C18柱为固定相，醋酸铵、乙腈与水的混合溶液作为流动相的UFLC-MS/MS方法，准确分析了酒和饮料中的7种偶氮类色素。

2.2.6 酶联免疫法（ELISA）

酶联免疫法是基于抗原与抗体的特异性结合原理来进行分析测定，它的被测物须是可以作为抗原或抗体的物质，该方法的最大特点就是特异性强、操作简单、灵敏度高、易于现场快速检测。

韩丹等[8]试验先通过对苏丹红I分子进行修饰，并交联载体蛋白得到了苏丹红I的完全抗原，免疫家兔后获得多克隆抗体，建立了测定食品中苏丹红I含量的ELISA方法，邢玥[9]同理设计得到了日落黄及胭脂红的多克隆抗体，建立了合适的ELISA方法，该方法具备较高的准确度，而且前处理简单，能够应用于食品中合成色素的快速检测。

2.2.7 其他方法

传统固相萃取技术的目标物与吸附剂之间的作用力是非特异性的，通常需要对萃取和洗脱条件进行仔细选择，而分子印迹技术（MIP）独特的选择性和亲和能力适应了这一需求，使得MIP-SPE技术对于目标物的选择性大大提高。同时，杨晶等[10]制作的日落黄分子印迹修饰电极通过微分脉冲伏安法测定了饮料中的日落黄，回收率大大提高。

此外，刘宇等[11]以甲基紫作为光谱探针，建立了分别测定日落黄和胭脂红的共振光散射光谱法（RLS），该方法利用甲基紫与合成色素通过静电作用形成离子缔合物能够增强共振光散射的强度，准确测定了饮料中的日落黄和胭脂红。

3 结论

针对食品中偶氮类合成色素的检测方法大体有以下3个发展趋势：一是简单快速，对食品的监管过程中往往要求检测机构在最短的时间内对其色素成分进行鉴定，这就要求检测设备简便，前处理过程简单；二是定性定量准确，食品中合成色素的检测关键在于准确的定性与定量，否则将对生产企业造成经济损失，并以损害消费者的身体健康为代价来纵容不法行为；三是多组分同时测定，合成色素的种类繁多，不法商贩可能向食品中添加各种合成色素，能够同时检测多种色素无疑可以提高对产品监管的效率。

因此，一种简单、准确、通用型的检测食品中偶氮类合成色素的方法，对于加强监管食品中的色素添加十分必要。

通过本文来看，使用ELISA试剂盒与HPLC-MS方法配合使用的检测方法，能够快速锁定食品中偶氮类合成色素的检测范围，并可进行样品的准确定量分析，希望有关食品监管部门考虑采用。

参考文献

[1] 曾盈，蔡智鸣，等.胭脂红对3T3细胞DNA损伤的SCGE检测[J].同济大学学报：医学版，2008，29：41-44.

[2] Sako F，Kobayashi N，etal. Cytotoxicity of food dyes on cultured fetal rat hepatocytes[J].Toxicology & Applied Pharmacology，1980，54（2）：285–292.

[3] 于淑池，张翼，等.偶氮类色素胭脂红对泥鳅组织酯酶同工酶表达的影响 [J].水产科学，2011，30：509-512.

[4] 张晓红，张虎芳.胭脂红对泥鳅红细胞微核的形成和核异常的影响[J].中国西部科技，2006：26-27.

[5] Bonan S， Fedrizzi G， et al. Simultaneous determination of synthetic dyes in foodstuffs and beverages by high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector [J]. Dyes and Pigments，2013，99（1）：36-40.

[6] Al-Degs YS. Determination of three dyes in commercial soft drinks using HLA/GO and liquid chromatography [J]. Food Chemistry，2009，117（3）：485-490.

[7] Zou T， He P， et al. Determination of seven synthetic dyes in animal feeds and meat by high performance liquid chromatography with diode array and tandem mass detectors[J].Food chemistry， 2013， 138（2）： 1742-1748.

[8] 韩丹，于梦，等.酶联免疫吸附分析法测定食品中的苏丹红Ⅰ号[J].分析化学， 2007，35：1168-1170.

[9] 邢玥.日落黄和胭脂红酶联免疫吸附测定法的建立 [D]；南开大学，2013.

[10] 杨晶.日落黄分子印迹修饰电极的制备及其应用研究[D]；辽宁师范大学， 2012.

[11] 刘宇.食用合成色素日落黄和胭脂红的分析方法研究 [D]；西北大学， 2013.