间歇低氧大鼠细胞外信号调节激酶与认知功能变化☆

张盼盼 韩晓庆 李琳 王红阳 王玲 郭秀华 雷军旗 杨林

间歇低氧大鼠细胞外信号调节激酶与认知功能变化☆

张盼盼*韩晓庆*李琳*王红阳*王玲*郭秀华*雷军旗*杨林*

目的 探讨间歇低氧对大鼠海马细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路及认知功能变化的影响。方法采用大鼠间歇低氧模型，将成年雄性Wistar大鼠(n=48)随机均分为5%间歇低氧组（5%intermittenthypoxia group,5%IH组）和空白对照组（unhandled control group,UC组），每组分别为24只大鼠，分别于间歇低氧第2、4、6、8周后采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆功能；免疫组化及免疫印迹法检测大鼠海马区磷酸化P-ERK1/2表达水平、免疫组化检测c-fos蛋白表达水平；TUNEL法检测神经元凋亡情况。结果与UC组比较，5%IH组在2、4、6、8周大鼠逃避潜伏期时间分别为（50.22±8.42）s、（57.13±9.06）s、（67.56± 5.42）s、（71.71±5.49）s，从第2周起随低氧时间延长大鼠逃避潜伏期时间延长（P＜0.05），5%IH组在2、4、6、8周大鼠跨越目标象限时间分别为（46.23±3.68）s、（39.36±3.42）s、（33.35±4.01）s、（26.82±4.30）s，从第2周起随低氧时间延长大鼠跨越目标象限时间缩短（P＜0.05），5%IH组p-ERKl／2、c-fos蛋白表达及凋亡指数在2、4、6、8周均多于UC组(P＜0.05)，5%IH组p-ERKl／2、c-fos蛋白表达及凋亡指数均有明显的时间差异性(P＜0.05)，均随间歇低氧时间的延长其表达先升高后降低，6周达到高峰(P＜0.05)，8周逐渐下降(P＜0.05)；UC组p-ERKl／2、c-fos蛋白表达及凋亡指数无时间差异性(P＞0.05)，5%IH组p-ERKl／2与c-fos蛋白的阳性表达相对值呈正相关（r值为0.977，P＜0.05），c-fos蛋白的阳性表达相对值与神经元凋亡指数呈正相关（r值为0.963，P＜0.05）。结论ERK通路的激活可能是OSAHS大鼠早中期认知功能损害发生的重要机制。

间歇低氧 海马 细胞外信号调节激酶 凋亡 认知

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)可引起不同程度的认知功能障碍[1-2]。ERK通路是经典的参与学习、记忆的通路[3]，与认知功能障碍密切相关，目前对ERK通路的相关研究主要集中在脑缺血缺氧、血管性痴呆等方面，但对ERK通路在间歇缺氧造成认知功能障碍中的作用研究较少，具体机制尚不清楚。因此本研究通过观察OSAHS大鼠ERK通路及神经元凋亡的变化，探讨其认知功能损害的发生机制。

1 材料与方法

1.1 动物雄性Wistar大鼠48只，体质量（170± 10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2006-0009。

1.2 动物分组与模型制作48只成年雄性Wistar大鼠采用随机数字法分为2组：5%IH组、UC组，每组又分为2、4、6和8周时间组，各时间组6只动物。按照参考文献[4]的方法制备5%IH组，具体方法如下：每天8：00 am～4：00 pm将5%IH组大鼠置于间歇低氧舱（天津医科大学研制）内，5%IH组大鼠循环交替给予不同流量氮气和压缩空气,每一循环120 s，前30 s为氮气，接着40 s为高流量压缩空气，最后50 s为低流量压缩空气，用数字测氧仪（建德市梅城电化分析仪器厂）监测舱内氧浓度变化，使5%IH组箱内前30 s氧浓度分别逐渐降至5%，接着40 s氧浓度逐渐恢复至21%，并维持50 s，保持各组舱内氧浓度维持在各自的氧浓度内，使其氧浓度波动范围在±0.5%以内；UC组大鼠不给予任何处理。试验结束将试验动物取出，送入常规饲养箱内自由饮水与摄食，生活环境及饲养条件相同。各组每天实验8 h，整个试验过程中两组大鼠均无死亡。

1.3 水迷宫测试按照参考文献[4]的方法，采用Morris水迷宫（淮北正华）进行检测。每只大鼠晨起训练5次后分别在上午、下午各测试6次，分别记录各组大鼠逃避潜伏期时间和跨越目标象限时间，单位时间为（s），取检测记录的总均值。

1.4 免疫组织化学检查及Western免疫印迹检测大鼠经戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg),迅速断头，冰上取脑，取出左右侧海马，分别行免疫组织化学检查及Western免疫印迹检测，免疫组织化学法严格按照PV法进行染色，镜下观察阳性细胞胞浆呈棕黄色。每例标本随机选取2张切片，每张切片再随机选取5个不同视野,采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析其积分光密度值(integrated option density，IOD),阳性细胞免疫反应性强弱的大小用IOD表示；Western免疫印迹检测由Image J分析系统软件分析蛋白条带的平均灰度值，以目的蛋白条带与内参照β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平,进行半定量分析。

1.5 原位细胞凋亡检测(TUNEL法)标本多聚甲醛固定,经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，按TUNEL检测试剂盒（Roche公司）进行操作。阳性率的定量分析:各组切片在相同倍数(20×10)镜下随机选取5个视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，凋亡指数=凋亡细胞数／总细胞数×100%。

1.7 统计学方法采用SPSS13.0进行数据分析，数据用（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果

2.1.1 定位航行实验 经过5 d寻找平台训练，与第1天比较，从第3天起各组大鼠逃避潜伏期明显缩短。UC组各时间点变化无统计学差异(P＞0.05)；5%IH组大鼠逃避潜伏期随间歇低氧时间变化逐渐延长(P＜0.05)，与UC组比较，5%IH组第2、4、6、8周大鼠逃避潜伏期均延长(P＜0.05（)见表1）。

2.1.2 空间探索实验 随低氧时间的加重，大鼠跨越目标象限时间缩短各组不同。UC组大鼠各时间点变化无统计学差异（P＞0.05）；5%IH组随低氧时间延长大鼠跨越目标象限时间明显缩短(P＜0.05)；与UC组比较，5%IH组大鼠跨越目标象限时间四个时间点均缩短(P＜0.05（)见表1）。

表1 各组大鼠水迷宫实验结果的比较(s)

表2 各组大鼠免疫组化及凋亡结果的比较

2.2 间歇低氧对大鼠海马CA1区神经元p-ERK 1/2蛋白表达的影响p-ERK1/2蛋白免疫组化阳性产物表达于细胞浆，呈棕黄色。正常对照组可见散在阳性细胞；p-ERKl／2蛋白免疫组化及免疫印迹法结果示，UC组CA1区神经元p-ERK1/2蛋白表达在不同时间水平上无统计学差异（P＞0.05）；5%IH组CA1区神经元p-ERK1/2蛋白表达在不同时间水平上有统计学差异（P＜0.05），表现为随时间的延长呈先升高后降低趋势，2周开始增加，6周达高峰，8周减少（P＜0.05），5%IH组CA1区神经元p-ERK1/2蛋白表达显著高于UC组（P＜0.05）（见图1，表2）。

2.3 间歇低氧对大鼠海马CA1区神经元c-fos蛋白表达的影响c-fos蛋白免疫组化阳性产物表达于细胞核，呈棕黄色。正常对照组可见散在阳性细胞，5%IH组c-fos蛋白免疫组化结果示其表达变化趋势同p-ERK1/2蛋白表达变化（见图2，表2）。

2.4 间歇低氧对大鼠海马CA1区神经细胞凋亡变化凋亡细胞形态呈圆形或椭圆形，细胞核呈棕黄色或棕褐色，形态呈碎点状，不规整，大小不一致，非凋亡细胞细胞核被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致。UC组海马CA1区凋亡指数不同时间水平无统计学差异（P＞0.05），5% IH组海马CA1区凋亡指数不同时间水平有统计学差异（P＜0.05），表现为先上升后下降趋势，于第6周凋亡指数达高峰后，于8周下降（P＜0.05），5% IH组凋亡指数显著高于UC组，且以5%IH组凋亡指数最高（P＜0.05）（见图3，表2）。

2.5 相关分析通过比较ERK1/2、c-fos免疫组化及TUNEL切片，发现ERK1/2阳性细胞的分布情况与c-fos及TUNEL标记的凋亡细胞有很大程度重叠，主要分布在海马CA1区。ERK1/2与c-fos的表达时相具有相续性，且阳性表达神经细胞在形态上相似，ERK1/2与c-fos呈正相关（R=0.977，P＜0.05）,c-fos与凋亡指数呈正相关（R=0.963，P＜0.05），这提示三者间可能存在内在联系。

3 讨论

ERK通路在认知方面如学习、记忆功能等方面发挥着关键作用[5-7]，目前在OSAHS引起的认知功能障碍的研究主要是P38及JNK[8-9]通路，但缺乏ERK通路与OSAHS认知功能障碍关系的相关研究，为此本研究通过模拟OSAHS间歇低氧的病理生理状态，首先探讨ERK在间歇低氧中的表达变化，其结果表明间歇低氧组海马CA1区的p-ERKl/2蛋白表达明显高于正常对照组，但p-ERKl/2蛋白随间歇低氧时程的延长，其表达呈现先上升后下降的趋势，可见间歇低氧可引起ERK蛋白表达，进而可能激活ERK信号通路。

C-fos蛋白是ERK通路的底物，其ERK激活后c-fos发生不同程度的表达，进而促进细胞的增殖和分化，c-fos为即刻早期凋亡基因[10]，在早期表达增多，在晚期则逐渐减少[11]。本研究结果提示间歇低氧组海马CA1区的c-fos蛋白表达明显高于正常对照组，其表达变化趋势但与pp-ERKl/2蛋白一致，均呈现先上升后下降的趋势。间歇低氧可导致p-ERKl/2蛋白表达，进而引起c-fos蛋白表达相应增多，可见ERK通路在间歇低氧大鼠海马CA1区被激活，在间歇低氧早中期可能发挥重要作用，参与细胞的生长、发育、分裂及死亡的调节。

ERK通路是经典的MAPK信号转导通路，与细胞凋亡的发生密切相关[12],间歇低氧后ERK信号通路被激活，其下游c-fos蛋白表达增多，可能会促进海马CA1区神经元发生凋亡，本实验利用TUNEL法检测海马CA1区神经元凋亡情况，其结果显示间歇低氧可引起神经元凋亡，神经元凋亡指数在间歇低氧组变化趋势与p-ERKl/2、c-fos蛋白表达的变化趋势大致相同。通过相关性分析提示p-ERKl/2与c-fos蛋白的表达呈正相关，同时c-fos蛋白的表达与神经元凋亡指数呈正相关，c-fos蛋白具有促进细胞凋亡的作用，在间歇低氧早中期阶段尤为明显，其表达增多，则引起海马CA1区神经元发生凋亡，表明ERK通路激活可造成海马CA1区神经元凋亡的发生。

图1 间歇低氧组与空白对照组海马CA1区p-ERK1/2蛋白的免疫印迹分析

图2 海马CA1区蛋白表达A为UC 2周组，B、C、D、E分别为5%IH 2周、4周、6周、8周组（免疫组织化学染色法400×）

图3 海马CA1区细胞凋亡变化A为UC 2周组，B、C、D、E分别为5%IH 2周、4周、6周、8周组（Tunel法400×）

海马CA1区是认知功能重要部位[13-14]，对各种刺激因素最为敏感，间歇低氧可引起海马CA1区神经元凋亡[15]，可能会造成认知功能障碍的发生，通过水迷宫检测间歇低氧大鼠学习记忆功能，结果显示间歇低氧组大鼠学习记忆功能明显下降，且随间歇低氧时间的延长，学习记忆功能逐渐下降，这与ERK通路的变化趋势不一致，实验中ERK通路的激活在间歇低氧早中期变化明显，晚期逐渐下降，但学习记忆功能却逐渐下降，这进一步说明ERK通路是间歇低氧早中期认知功能障碍形成的主要因素之一，但在其后期形成过程中，可能存在其他病理生理机制参与认知功能障碍的形成。

间歇低氧可引起ERK通路激活，导致c-fos蛋白表达，进而可能造成海马CA1区神经元凋亡，长时程间歇低氧刺激，可能会导致ERK通路逐渐失活，这说明ERK通路的激活可能是OSAHS大鼠早中期认知功能损害发生的重要机制，这可能为今后早期干预OSAHS认知功能障碍形成提供方法和具有重要的临床意义。

[1] Sateia MJ．Neuropsychological impairment and quality of life in obstructive sleepapnea[J]．Clin chest Med，2003，24(2)：249-259．

[2] Ayalon L,Peterson S.Functional central nervous system imaging in the investigation of obstructive sleep apnea[J].Curr Opin Pulm Med,2007,13(6):479-483．

[3] 胡亚卓,吕佩源,李玲,等.盐酸多奈哌齐对血管性痴呆模型小鼠海马神经元ERK表达的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2008,15(1):462-491.

[4] 王红阳,韩晓庆,赵雅宁,等.重度间歇低氧大鼠学习记忆功能与氧化应激的关系[J].中华结核和呼吸杂志,2012,35(1): 24-28.

[5] Sweatt JD.Motigen-activated protein kinases in synaptic plasticity andmemory[J].Curr Opin Neurobiol,2004,14:311-317.

[6] Mariana F,Beatriz D,A lejandro D,etal.Phosphorylation of extra-nuclear ERK/MAPK is required for long-term memory consolidation in the crab Chasmagnathus[J].Behavioural Brain Res, 2005,158（2）:251-261.

[7] Samuels IS,Karlo JC,Faruzzi AN,etal.Deletion of ERK2Mitogen-Activated Protein Kinase Identifies Its Key Roles in Cortical Neurogenesis and Cognitive Function[J].The Journal of Neuroscience,2008,28(27):6983-6995.

[8] 王红阳,赵亚宁,陈宝元,等.重度间歇性低氧对大鼠认知功能及海马区磷酸化P38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志，2012,21(11):972-975.

[9] 周永海，蔡晓红.慢性间歇低氧对幼鼠脑区P38MAPK的影响[J].中国应用生理学杂志，2009,25(1):45-48.

[10] Chambard JC,Lefloch R,Pouysségur J,et al.ERK implication in cell cycle regulation[J].Biochim Biophys Acta,2007,1773(8): 1299-1310.

[11] Foster-Barber A,Dickens B,Ferriero DM．Human perinatal asphyxia：correlation of neonatal cytokines with MRI and outcome[J]．Dev Neurosci，2001，23(3)：213-218．

[12] Shougang Zhuan，Rick GS．A Death-promoting role for extracellular signal-regulated kinase[J]．JPET Fast Forward，2006，7(26)：1067-1073．

[13] Kim JJ,Song EY,Kosten TA.Stress effects in the hippocampus：synaptic plasticity andmemory[J].Stress，2006,9:1-11.

[14] 范鸣玥，郭艳苏，张维娜，等.血管性痴呆小鼠海马组织GSK3β、p-GSK3β蛋白的动态表达及意义[J].中国神经精神疾病杂志，2013,39(9)：553-556.

[15] 史艳萍，徐平，宋凯英，等.阻塞性睡眠呼吸暂停综合征大鼠海马病理改变及caspase-3的表达[J].中国神经精神疾病杂志，2013,39(8)：496-499.

The effect of intermittent hypoxia on hippocampal ERK signaling and cognitive function in rats.

ZHANG Panpan，HAN Xiaoqing,LI Lin，WANG Hongyang，WANG Ling，GUO Xiuhua，LEI Junqi,YANG Lin.
Department of respiration of Hebeiunited University Hospital，Tangshan 063000，China.Tel:031-53726331.

ObjectiveTo investigate ERK pathway and cognitive function after intermittent hypoxia in rats.MethodsChronic intermittent hypoxia was adopted tomimic obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome(OSAHS)in rats. MaleWistar rats(n=48)were random ly divided into two groups(24 animal each):5%IH group and UC group.Morriswatermaze was used to assess learning and memory function at 2,4,6 and 8 weeks following chronic intermittent hypoxia. Immunohistochemical and Western blotwere used to detect the expression of P-ERK1/2 and c-fos in CA1.TUNEL was used to examine apoptosis in CA1.ResultsThe escape latency time was 50.22±8.42,57.13±9.06,67.56±5.42,and 71.71±5.49 at2,4,6 and 8 weeks in 5%IH group,respectively.Compared with UC group，the escape latency time was significantly prolonged atall time points(P＜0.05).The escape latency timewas 46.23±3.68,39.36±3.42,33.35±4.01 and26.82±4.30 at 2,4,6 and 8 weeks in 5%IH group,respectively.Compared with UC group，the time across the target quadrant was significantly prolonged at all time points(P＜0.05),Chronic hypoxia-induced expression of p-ERKl／2，c-fos and apoptotic index started from 2 weeks,peaked at6 weeks(P＜0.05)and then decreased at8 weeks(P＜0.05)following chronic hypoxia induced activation.There were positive correlations between p-ERKl／2 and c-fos expression values（r=0.977，P＜0.05）and between c-fos relative expression values and apoptotic index（r=0.963，P＜0.05）.ConclusionActivation of ERK pathwaymay be an importantmechanism underlying early andmiddle cognitive impairment in a ratmodel of OSAHS.

Intermittenthypoxia Extracellular signal-regulated kinase Hippocampus Apoptosis Cognitive function

R743.3

A

2014-02-26）

（责任编辑：李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.09.002

☆河北省高等学校科学技术研究重点项目，河北省重大课题资助项目，河北省自然科学基金资助项目（编号：ZH2011120、zd2013091、H2014209231）

*河北联合大学附属医院呼吸科（唐山 063000）