β-Arrestin1介导低氧诱导的大鼠皮层CRFR1内在化*

元 媛，孔繁平，郝 珂，孟凡森，陈学群，杜继曾

（浙江大学基础医学系神经生物学和生理学研究室，杭州310058）

低氧是一种非特异性应激，刺激机体生理功能产生一系列反应，表现为呼吸和心率增加、通气量增加、心输出量增多等，机体可以通过不同的分子机制来感受和适应低氧环境。哺乳动物通过下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamus-pituitary-adrenalaxis，HPA axis）调节机体对外界的应答和适应反应。下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing factor，CRF）是HPA轴的启动者［1］，它调节神经和体液两大系统。其受体有CRFR1和CRFR2，其中CRF主要与CRFR1结合发挥重要生理作用。CRFR1属G-蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCRs）家族，广泛分布于脑和垂体。我们已研究证明CRFR1参与低氧应激生理功能调节，对神经-内分泌-免疫网络系统中重要低氧靶基因和蛋白起核心主导调节作用［2］。

β-Arrestin是GPCRs信号通路的重要负调节因子，在机体组织广泛存在，包括β-Arrestin1和β-Arrestin2。激活的GPCRs与G蛋白偶联受体激酶（G-protein-coupled receptor kinases，GRK）结合后发生磷酸化，使β-Arrestin与GPCRs结合形成三聚体，使受体与G蛋白之间不能继续作用，发生GPCRs的脱敏反应，从而调节了GPCRs的内吞、信号转导及细胞凋亡等［3］。GRK3也和β-Arrestin一起共同参与调节GPCRs的内在化［4］，所以本研究探讨慢性低氧诱导的β-Arrestin1如何参与CRFR1脱敏以降低机体对低氧的反应性。

1 材料与方法

1.1 动物饲养

实验采用健康雄性、清洁级SD大鼠，体重（170±20）g，购自浙江省医学科学院实验动物中心。人工控制光照（12L∶12D，光照时间为 6∶00-18∶00），环境温度（20±2）℃，湿度为（50±5）%，饲养于30 cm×30 cm×25 cm的饲养笼中，每天9∶00称量体重，打扫卫生。大鼠可自由取食和饮水，饲养一周后用于实验。

1.2 模拟低氧应激

采用将动物大鼠置于透明的低压低氧舱内（贵州风雷航空军械有限责任公司）模拟高原低氧，低氧组分为慢性连续低氧 5 km（10.8%O2，54.02 kPa）5 d、5 km（10.8%O2，54.02 kPa）15 d和急性低氧 7 km（8.2%O2，41.02 kPa）8 h、7 km（8.2%O2，41.02 kPa）24 h，共四个低氧组（n＝6），对照组（n＝6）不给予低氧处理。低氧结束后，大鼠被断头牺牲取样。动物在舱内有足够的食物和水，而且光线、温度、湿度都与饲养环境相同。

1.3 组织准备

低氧处理后，动物被迅速断头牺牲取大脑，用液氮冷冻后保存在-80℃。取出约50mg前额叶皮层进行实验研究。

1.4 实时定量PCR

前额叶皮层提取总RNA，采用逆转录方法，使用TransGen Biotech公司的TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（AT301）合成 cDNA，进行 Quantitative Real Time PCR（采用Takara公司的 SYBR Premix Ex TaqTM）。CRF、CRFR1、GRK3、β-Arrestin1和18S荧光定量PCR引物如下（表1）。经过Q-PCR反应，发现以下引物反应之后电泳条带没有杂带，融解曲线较好。

Tab.1 Sequences of Primers for PCR

1.5 统计学处理

数据用SPSS 15.0软件分析，数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 低氧诱导大鼠大脑前额叶皮层CRF基因表达改变

急性7 km低氧8 h可以增加大鼠大脑前额叶皮层CRF mRNA表达（P＜0.05），7 km低氧 24 h CRFmRNA表达和对照组相比没有显著性差异；而5 km慢性连续低氧5 d和15 d后，CRFmRNA基因表达与对照组比较无明显差异（图1）。

2.2 低氧诱导大鼠大脑前额叶皮层CRFR1基因表达改变

急性7 km低氧8 h可以增加大鼠大脑前额叶皮层CRFR1mRNA表达（P＜0.001），7 km低氧 24 h，CRFR1 mRNA表达明显减少（P＜0.05）；而5 km慢性连续低氧5 d和15 d后，CRFR1mRNA基因表达恢复到对照水平，与对照组比较无明显差异（图 2）。

2.3 低氧诱导大鼠大脑前额叶皮层GRK3基因表达改变

急性7 km低氧8 h可以增加大鼠大脑前额叶皮层GRK3 mRNA表达（P＜0.05），而 7 km低氧 24 h，GRK3 mRNA表达明显减少（P＜0.05）；5 km慢性连续低氧5 d明显降低GRK3 mRNA表达（P＜0.05），而连续低氧15 d后，GRK3mRNA表达恢复对照组水平（图3）。

2.4 低氧诱导大鼠大脑前额叶皮层β-Arrestin1基因表达改变

急性7 km低氧8 h后大鼠大脑前额叶皮层β-Arrestin1 mRNA表达明显减少（P＜0.05），7 km低氧24 h后β-Arrestin1 mRNA表达没有差异；5 km慢性连续低氧5 d后，β-Arrestin1 mRNA表达仍没有差异，而连续低氧15 d后β-Arrestin1 mRNA表达明显升高（P＜0.05，图 4）。

Fig.1 Effectsofhypoxia on ratCRFmRNA in cortex（±s，n＝6）

Fig.2 Effects of hypoxia on rat CRFR1 mRNA in cortex（±s，n＝6）

Fig.3 Effects of hypoxia on ratGRK3mRNA in cortex（±s，n＝6）

Fig.4 Effects of hypoxia on ratβ-Arrestin1mRNA in cortex（±s，n＝6）

3 讨论

低氧通过HPA轴引起机体神经内分泌、免疫、自主神经功能以及行为反应改变。我们实验室已经报道低氧激活HPA轴，促进下丘脑PVN区、正中隆起ME以及杏仁核处CRF分泌。低氧应激后，HPA轴活性增强，血浆ACTH和皮质酮水平也显著升高，CRFR1在低氧应激过程中发挥重要的作用，注射CRFR1拮抗剂后，这些作用不同程度地被阻断，表明CRFR1是低氧应激反应的调节中心［5］。我们发现暴露于慢性连续低氧后HPA轴活性降低，机体反应性也下降。本实验的研究结果显示，急性低氧7km 8 h上调 CRF、CRFR1和GRK3基因表达，而7 km 24 h严重低氧抑制CRFR1和GRK3基因表达。以上结果提示，在急性低氧下CRF和CRFR1的表达增加有相同的趋势。在急性低氧下，应激早期虽然GRK3表达增多，但是 CRF和 CRFR1表达增加，以及β-Arrestin1表达下降，HPA轴功能仍处于激活状态，机体充分展示出在急性低氧应激后的神经内分泌系统的快速反应调节。

在暴露于慢性连续低氧应激后，β-Arrestin1mRNA表达上调，而CRFR1基因表达明显下调。我们推测GRK3使激活的CRFR1上的丝氨酸或苏氨酸磷酸化，并结合成复合物，然后β-Arrestin1与该复合物结合，导致G蛋白不能与CRFR1偶联，发生了脱敏反应，进而调节CRFR1内在化。β-Arrestin1在急性低氧下的降低和慢性连续低氧应激下的升高提示了β-Arrestin1对慢性低氧下CRFR1脱敏的重要作用。在慢性连续低氧后，机体CRF分泌减少，及GRK3mRNA表达水平逐渐恢复对照组水平，同时参与受体脱敏的β-Arrestin1 mRNA显著增加的共同作用可能使CRFR1发生内在化，提示β-Arrestin1参与了慢性连续低氧下CRFR1脱敏和内吞。

急性低氧CRF和CRFR1表达增加，HPA轴功能激活，机体充分展示出急性低氧应激后的神经内分泌系统的快速反应调节。而在慢性连续低氧后，CRF分泌减少，β-Arrestin1增加使CRFR1内在化，提示β-Arrestin1参与了CRFR1脱敏和内吞，这可能是慢性低氧适应性的机制之一。

【参考文献】

［1］ De Souza EB.Corticotropin-releasing factor receptors：physiology，pharmacology，biochemistry and role in central nervous system and immune disorders［J］.Psychoneuroendocrinol，1995，20（8）：789-819.

［2］ Wang TY，Chen XQ，Du JZ，etal.Corticotropin-releasing factor receptor type 1 and 2mRNA expression in the ratanterior pituitary ismodulated by intermittent hypoxia，cold and restraint［J］.Neurosci，2004，128（1）：111-119.

［3］ Gurevich V V，Gurevich E V.The structural basis of arrestin mediated regulation of G protein coupled receptors［J］.PharmacolTher，2006，110（3）：465-502.

［4］ Dautzenberg FM，Braun S，Hauger R L.GRK3mediates desensitization of CRF1 receptors：a potentialmechanism regulating stress adaptation［J］.AmJPhysiolRegulIntegrComp Physiol，2001，280（4）：R935-946.

［5］ Xu JF，Chen XQ，Du JZ，etal.CRF receptor type 1mediates continual hypoxia-induced CRF peptide and CRFmRNA expression increase in hypothalamic PVN of rats［J］.Peptides，2005，26（4）：639-646.