环境对转基因小鼠抑郁样行为的影响☆

陈静 李晗△※ 张晨 王祖承 崔东红△※

环境对转基因小鼠抑郁样行为的影响☆

陈静*李晗*△※张晨*王祖承*崔东红*△※

目的 探讨环境因素对精神分裂症断裂基因1（disruptedinschizophrenia1，DISC1）转基因小鼠抑郁样行为的影响。方法C57BL/6野生型新生小鼠及C57BL/6 LBD-DISC1转基因新生小鼠各16只，分别随机分为野生实验组、野生对照组和DISC1实验组、DISC1对照组，每组8只。实验组小鼠在哺乳期进行6 d母婴分离，成年早期给予21 d慢性不可预知轻度应激，采用糖水消耗实验及强迫游泳实验测定四组小鼠行为，并比较各组小鼠的体质量改变。结果应激和DISC1缺陷对小鼠糖水偏好度没有交互作用（P＞0.05），DISC1实验组糖水偏好度低于其余三组（均P＜0.01）；应激和DISC1缺陷对小鼠强迫游泳实验的静止时间有交互作用（P=0.010），DISC1实验组小鼠强迫游泳的静止时间长于野生对照组和DISC1对照组（均P＜0.01）；应激和DISC1缺陷对体质量改变亦没有交互作用（P＞0.05），但DISC1实验组低于其余三组（均P＜0.01）。结论应激和DISC1缺陷共同作用导致小鼠出现抑郁样行为。

母婴分离 慢性不可预知轻度应激 糖水消耗实验 强迫游泳实验 抑郁症

【Key words】Maternal separation Chronic unpredictablemild stress The sucrose consumption The forced swim test Depression

目前已经建立的抑郁症动物模型有药理学模型、基因操作模型、行为学模型、环境应激模型等，这些均为单一因素建模。而近年来有研究者提出基因、环境双重因素假设[1-2]，认为采用遗传与环境应激相结合的方式建立抑郁症动物模型能更好地模拟抑郁症的自然发病机制。精神分裂症断裂基因1（disruptedinschizophrenia1，DISC1）是近年发现的抑郁症易感基因之一[3]。本研究基于以上理论基础，以DISC1转基因小鼠为载体，采用母婴分离复合慢性不可预知轻度应激方式，研究环境因素对DISC1转基因小鼠抑郁样行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物采用雄性C57BL/6野生型新生小鼠及C57BL/6 DISC1配体结合区域转基因（C57BL/6 LBD-DISC1转基因）新生小鼠各16只，分别随机分为野生实验组、野生对照组及DISC1实验组、DISC1对照组，每组8只。C57BL/6野生型小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。C57BL/6 LBD-DISC1转基因小鼠由李卫东实验室赠送，该转基因小鼠为国际同行认可的基因工程小鼠模型之一，其转基因系统可诱导。在没有诱导剂（他莫昔芬Tamxiofen）时，DISC1转基因融合蛋白虽可表达，但被热休克蛋白包裹，而进入蛋白降解过程；当注射诱导剂时，短片段DISC1转基因融合蛋白被解放，从而与野生型DISC1竞争目的蛋白的结合位点，破坏DISC1正常功能[4]。本研究在小鼠出生后第7天注射诱导剂他莫昔芬（Sigma，美国）制备LBD-DISC1转基因小鼠。本实验方案获得上海市精神卫生中心伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 模型构建 将母鼠与新生小鼠置于室温22±3℃（热、冷应激除外）、相对湿度55%～60%、12 h/12 h光/暗（灯亮时间为早5时至晚5时，通宵照明应激除外）环境中饲养，允许自由进食、进水（禁食禁水应激除外）。出生后7～12 d，对野生实验组及DISC1实验组进行为期6 d的母婴分离，3 h/d。出生后70～90 d期间，对野生实验组及DISC1实验组进行为期21 d的慢性不可预知轻度应激刺激，包括通宵照明（实验室光源连续24 h开启）、倾斜鼠笼（持续16 h将鼠笼倾斜45°）、夹尾（持续1 min）、摇晃（将小鼠放在240 r/min的摇床上5 min）、禁食禁水（持续24 h）、冰水游泳（将小鼠放置在4℃冰水中游泳5min）、潮湿垫料（垫料中倾倒150mL水，16 h后换垫料）。以上8种措施随机采用，使小鼠无法预测。野生对照组和DISC1对照组只进行常规更换食水、垫料操作。

1.2.2 糖水消耗实验 小鼠出生后91 d即成年后进行糖水消耗实验。在经过23 h的禁食禁水后，给予每只小鼠事先定量好的1瓶1%蔗糖水和1瓶纯水。60min后，取瓶并称质量。计算总液体消耗量、糖水偏好度（糖水偏好度=糖水消耗量/总液体消耗量×100%）。糖水偏好度是对奖励的反应，对应抑郁症的快感缺乏症状。

1.2.3 强迫游泳 小鼠出生后95 d即成年后进行强迫游泳实验。将小鼠放入水深30 cm的圆柱形透明容器中使之游泳，起初小鼠挣扎试图逃脱，很快变为不动状态。实验分为2天进行，第1天单只小鼠放入水中15 min，取出后在32℃温室烘干，归笼。24 h后再次实验，记录放入水中5min内的累计不动状态时间为静止时间。强迫游泳中静止时间反映小鼠的抑郁情绪。

1.2.4 体质量 在小鼠出生后60 d及91 d时，测量每只小鼠的体质量，并计算体质量改变。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计分析。糖水偏好指标、强迫游泳中静止时间，以及体质量变化中应激和DISC1基因缺陷的作用采用两因素方差分析法进行分析，采用LSD法进行两两比较。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 小鼠糖水偏好度应激（F=68.33，P＜0.01）与DISC1基因缺陷（F=43.30，P＜0.01）对小鼠糖水偏好度的主效应均有统计学意义，但是两者没有交互作用（F=1.47，P=0.24）。对各组数据两两比较发现，野生对照组小鼠的糖水偏好度高于其余三组（P＜0.01），野生实验组与DISC1对照组小鼠的糖水偏好度无统计学差异（P＞0.05），DISC1实验组小鼠的糖水偏好度低于野生实验组和DISC1对照组（P＜0.01）。慢性应激（F=0.27，P=0.61）、DISC1基因（F=0.10，P=0.75）对小鼠总液体消耗量的主效应均无统计学意义，且两者无交互作用（F= 0.33，P=0.57）。见表1。

2.2 小鼠强迫游泳中静止时间应激对小鼠强迫游泳实验中静止时间的主效应有统计学意义（F= 171.87，P＜0.01），DISC1基因缺陷的主效应没有统计学意义（F=1.36，P=0.26），但是两者之间有交互作用（F=8.57，P=0.01）。对各组数据两两比较发现，与野生对照组相比，野生实验组和DISC1实验组小鼠的静止时间较长（P＜0.01），DISC1对照组小鼠的静止时间较短（P＜0.05）；DISC1实验组小鼠的静止时间长于DISC1对照组（P＜0.01），但是与野生实验组比较无统计学差异（P＞0.05）。

表1 小鼠糖水消耗实验与强迫游泳实验结果（±s）

表1 小鼠糖水消耗实验与强迫游泳实验结果（±s）

1）与野生对照组比较，经LSD-t检验，P＜0.01；2）与DISC1实验组比较，经LSD-t检验，P＜0.01；3）与DISC1对照组比较，经LSD-t检验，P＜0.01

强迫游泳静止时间（s）167.80±5.721)141.20±8.473)172.40±2.191)3)130.50±3.87组别野生实验组野生对照组DISC1实验组DISC1对照组n8 8 8 8糖水偏好度0.47±0.131)2)0.78±0.093)0.13±0.071)3)0.55±0.04总液体消耗量（mL）3.32±0.86 3.35±0.93 3.45±1.20 2.87±1.64

表2 小鼠体质量测量结果（±s）

表2 小鼠体质量测量结果（±s）

1）与野生对照组比较，经LSD-t检验，P＜0.01；2）与DISC1实验组比较，经LSD-t检验，P＜0.01；3）与DISC1对照组比较，经LSD-t检验，P＜0.01

组别野生实验组野生对照组DISC1实验组DISC1对照组n8 8 8 8出生后60 d（g）18.74±0.5020.76±0.7919.40±0.4920.44±0.62出生后91 d（g）22.14±0.8426.72±1.1320.44±0.5223.95±0.31体质量改变（g）3.40±0.741)2)5.96±1.723)1.04±0.801)3)3.68±0.59

2.3 小鼠体质量变化应激（F=27.20，P＜0.01）与DISC1基因缺陷（F=21.743，P＜0.01）对小鼠体质量改变的主效应均有统计学意义，但是两者没有交互作用（F=0.01，P=0.94）。对各组数据两两比较发现，野生对照组小鼠的体质量改变高于其余三组（P＜0.01），DISC1实验组小鼠的体质量改变低于其余三组（P＜0.01）。见表2。

3 讨论

目前认为抑郁症是基因与环境相互作用导致的。DISC1基因是新近提出的抑郁症易感基因之一[3]，多项研究显示DISC1基因与抑郁症相关[5]。基因关联研究报道，DISC1基因SNP（Ser704Cys）的Cys704等位基因增高抑郁症发病的危险度[6]。基于人群的研究显示，DISC1变异与复发性抑郁症的发病年龄等相关[7]。对DISC1基因突变小鼠的研究显示，DISC1基因缺陷小鼠表现出社会快感缺乏等抑郁样行为。本研究显示出与之类似的结果，DISC1基因缺陷对小鼠糖水偏好度和体质量改变的主效应均有统计学意义，说明DISC1基因缺陷导致小鼠快感缺乏、体重较低。

在遗传因素之外，抑郁症也深受环境的影响，而应激是最重要的环境因素。动物实验显示，早年生活应激可通过下丘脑—垂体—肾上腺轴导致应激引起的神经内分泌反应增强以及成年后的抑郁[8-10]。在早年应激产生长期破坏性后果的基础上，成年期生活事件导致抑郁症的发病。相关动物实验显示，慢性应激影响啮齿类动物的体重[11-12]；慢性不可预知应激使小鼠在鼠尾悬吊实验中的静止时间增加[13]，广泛用于制作抑郁症动物模型[14]；慢性社会应激导致社会回避、糖水消耗减少、强迫游泳的静止时间增加等抑郁样表现[15]。本研究对小鼠采用早年母婴分离和成年期慢性不可预知轻度应激相结合的方式模拟人类患者在整个生命历程中的应激模式，结果显示，应激组小鼠糖水偏好度更低，强迫游泳实验的静止时间更长，体质量改变更少，表明应激可导致小鼠快感缺失、行为绝望、体重下降等抑郁样表现。

以上结果表明，单一的DISC1缺陷或环境应激就可以显现出一些抑郁样行为改变。但是目前有关环境因素对基因缺陷小鼠抑郁样行为的影响的相关研究还较少，而环境诱因作用于基因缺陷对象导致抑郁症发生的这一模式，更符合人类精神疾病的自然发病过程。本研究采用DISC1缺陷作为基因因素，早年母婴分离与成年早期慢性不可预知轻度应激相结合的复合慢性应激作为环境因素，结果发现，环境和DISC1基因缺陷对强迫游泳实验的静止时间有交互作用。这与已有的同类研究结果相一致[16]，如DISC1基因突变小鼠复合胎儿聚肌胞注射、朊蛋白启动子调控的DISC1转基因小鼠复合社会隔离的交互模型，均显示出强迫游泳静止时间延长的抑郁样行为[17-18]。但是基因和应激对糖水偏好度和体重的影响都没有协同作用，这可能与小鼠的活动度、行为测试实验的设计等有关。已有的多项研究也提示，基因或环境因素对不同的行为实验产生不同的影响，而其中的具体机制还需要继续研究。

综上所述，环境因素作用于基因缺陷小鼠导致抑郁发生，相比环境或基因单一因素导致抑郁，这能更好地模拟人类自然发病过程，为更准确地研究抑郁症的发病机制和治疗提供了基础。本研究仅采用反映抑郁症核心症状的行为学实验作为评价指标，在进一步的研究中，还需纳入更多的行为学、生理学、药理学评价指标，从多方面验证本模型的信效度。

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The influence of environment on depressive-like behavior of transgenic mice.

CHEN Jing,LI Han,ZHANG Chen,WANG Zucheng,CUI Donghong.
Shanghai Mental Health Center,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200030,China.Tel:021-64387250.

ObjectiveTo investigate the influence of environment on despressive-like behavior in DISC1 transgenic mice.MethodsSixteen C57BL/6 wild-typemice were random ly assigned into two groups,the WT-stress group and theWT-control group.Sixteen C57BL/6 LBD-DISC1 transgenicmicewere also randomly assigned into 2 groups,the DISC1-stress group and the DISC1-control group.TheWT-stress group and the DISC1-stress group received daily 3 h maternal separation for six consecutive days and chronic unpredictablemild stress for 21 consecutive days.The sucrose consumption and the forced swim testwere used to evaluate depressive-like behaviors.The changes of bodyweightwere measured.ResultsTherewas no interaction(P＞0.05)between environment and gene associated with the preference for sucrose solution.However,the preference for sucrose solution was lower in the DISC1-stress group than in the rest 3 groups(P＜0.01).Interaction between environment and gene associated with the immobility time was significant(P= 0.010)in the forced swim test.The immobility time was longer in the DISC1-stress group than in theWT-control group (P＜0.01).The bodyweightwas lower in the DISC1-stress group than in the rest3 groups(P＜0.01).But the interaction of environmentand gene associated with bodyweightwas not significant(P＞0.05).ConclusionThe interaction of gene and environment can induce depressive-like behavior inmice.

R749.4

A

2014-08-25）

（责任编辑：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.09.008

☆上海市科技发展基金实验动物研究项目（编号：12140904200）；国家自然科学基金（编号：81171266；81271481）；上海市重性精神病重点实验室（编号：13dz2260500）

*上海交通大学医学院附属精神卫生中心（上海 200030）

△上海市重性精神病重点实验室

※上海交通大学精神疾病转化医学研究重点实验室