电休克和氯胺酮对抑郁模型大鼠海马区谷氨酸受体NR1及GluR1的影响☆

郝学超 闵苏 朱贤林 黎平 律峰 魏珂 谢飞

电休克和氯胺酮对抑郁模型大鼠海马区谷氨酸受体NR1及GluR1的影响☆

郝学超*闵苏*朱贤林*黎平*律峰*魏珂*谢飞*

目的 研究电休克（electroconvulsive shock，ECS）及氯胺酮对抑郁模型大鼠行为学及海马区α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受体1亚基（glutamate receptor subunit 1，GluR1）及N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体1亚基（NMDA receptor subunit1，NR1）表达的影响。方法采用慢性轻度不可预见性应激（chronic unpredictablemild stress，CUMS）法建立抑郁大鼠模型。选择成功建模大鼠30只，随机分为电休克组、氯胺酮组、模型组等3组，每组各10只。电休克组大鼠每日行ECS处理1次，连续7 d；氯胺酮组大鼠每日腹腔注射氯胺酮10mg/kg，连续7 d；模型组大鼠不进行实验处理。处理后，采用糖水偏好实验评价大鼠抑郁状态，Morris水迷宫实验评价学习记忆能力。采用Western-blot检测海马区GluR1和NR1表达水平。结果电休克组、氯胺酮组糖水偏好百分比均较模型组升高（均P＜0.05）；与模型组和氯胺酮组相比，电休克组逃避潜伏期延长，空间探索时间缩短（均P＜0.05）。与模型组相比，电休克组、氯胺酮组GluR1表达量增加（均P＜0.05）；电休克组NR1表达下降，而氯胺酮组NR1表达量增加（均P＜0.05）。结论电休克及氯胺酮均能上调AMPA受体GluR1亚基表达，同时氯胺酮上调NMDA受体NR1亚基表达，而电休克下调NR1亚基表达，电休克及氯胺酮对抑郁大鼠抑郁行为学及学习记忆功能影响的差异可能与其对NR1及GluR1亚基表达影响的不同有关。

抑郁 电休克 氯胺酮 NMDA受体 AMPA受体

电休克治疗（electroconvulsive therapy，ECT）及药物氯胺酮均具有快速抗抑郁效应[1-2]。ECT抗抑郁同时可影响认知功能[3]，研究发现氯胺酮不损伤抑郁大鼠认知功能，甚至减轻ECT所引起的认知功能损害[4]，机制与其阻滞N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受体有关[5]。而NMDA受体及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受体表达或转运调控异常会损害突触可塑性及学习记忆功能[6-7]。此外，NMDA受体及AMPA受体是ECT和氯胺酮共同潜在作用靶点。目前ECT损害认知功能的发生机制尚未明确，ECT和氯胺酮抗抑郁效应的差异是否与其对NMDA受体和AMPA受体的影响不同有关，目前尚不清楚。电休克（electroconvulsive shock，ECS）是动物中模拟的ECT，本研究以抑郁大鼠为对象，观察ECS和氯胺酮对抑郁大鼠海马区NMDA受体及AMPA受体表达的影响，以期更进一步探讨ECT和氯胺酮抗抑郁效应差异的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与建模清洁级健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200～250 g，2～3月龄（由重庆医科大学实验动物中心提供），于标准实验环境中（自由采食摄水、12 h/12 h昼夜规律交替、温度22±2℃）适应性饲养7 d。采用孤养与慢性轻度不可预见性应激法（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立抑郁模型。方法如下：大鼠单笼饲养，每日随机采用禁食24 h、禁水24 h、4℃冰水游泳5min、45℃热水游泳5min、鼠笼水平摇晃1次/ s持续15min、鼠笼倾斜45°持续24 h、潮湿垫料24 h、夹尾1min、昼夜颠倒等10种轻度刺激中的1种处理大鼠，同种刺激不连续2 d出现，建模持续28 d。本实验通过重庆医科大学伦理委员会审批。

1.2 分组与处理选择建模成功的抑郁模型大鼠（CUMS处理后糖水偏好百分比降至处理前80%以下）30只，随机分成电休克组、氯胺酮组和模型组，每组10只。电休克组大鼠腹腔注射异丙酚（浓度10mg/mL，批号：KB895，AstraZeneca公司，意大利）80mg/kg，于翻正反射消失后给予ECS处理。ECS采用改良电休克治疗仪（Niviqure-Computerized,Niviqure公司，印度）以双相矩形波（频率125 Hz，波幅0.8 A、波宽1.5ms）实施，以引发大鼠强直—阵挛抽搐发作为成功标准。ECS处理期间，大鼠吸入50%O2，监测SpO2。氯胺酮组大鼠每日相应时间腹腔注射氯胺酮（稀释至浓度1 mg/mL，批号：KH091201，江苏恒瑞医药股份有限公司）10 mg/ kg。以上实验处理1次/d，连续7 d。模型组大鼠不接受实验处理。

1.3 行为学检测于建模前、建模后（实验处理前）及实验处理后采用糖水偏好实验评价大鼠抑郁状态。首次实验前先进行糖水适应，即每笼投放2瓶1%蔗糖溶液，放置24 h，而后将其中1瓶蔗糖溶液更换为纯水，继续适应24 h。而后禁食、禁饮23 h后，同时放置1%蔗糖溶液和纯水各1瓶，为避免位置偏好引起的误差，实验30min后暂停测量，暂停30min后将纯水和蔗糖溶液位置调换，继续实验测量30min。分别测量每只大鼠糖水和纯水的消耗量，计算糖水偏好百分比[糖水偏好百分比=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%]。

于实验处理前、处理后采用Morris水迷宫评价大鼠学习记忆功能。Morris水迷宫实验共需进行6 d。前1～5 d进行定位巡航实验，评估大鼠学习功能。即平台置于Ⅰ象限（第2次水迷宫实验将平台置于Ⅱ象限）中心、水面下1.5 cm处，将大鼠随机从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限起点处面朝桶壁背对平台放入水中。记录大鼠自下水点至爬上平台的时间，计为逃避潜伏期。若60 s内大鼠无法登上平台，则将大鼠轻柔引导至平台上，计逃避潜伏期为60 s。每次巡航实验后，大鼠于平台上停留15 s，再行下一次实验，每只大鼠每象限各进行1次，共4次。取第3～5 d逃避潜伏期平均值作为最终成绩。第6 d进行空间探索实验，评估大鼠记忆功能。即撤去平台，将大鼠于原平台所在象限之相反象限下水点放入水中，记录60 s内大鼠在原平台所在象限内的游泳时间，计为其空间探索时间。

1.4 海马区AMPA受体1亚基（glutamate receptor subunit 1，GluR1）及NMDA受体1亚基（NMDA receptor subunit 1,NR1）表达检测Morris水迷宫实验后，每组随机选取5只大鼠，于腹腔注射0.5%戊巴比妥50mg/kg，麻醉下断头并分离完整大脑。在干冰上精细分离大鼠双侧海马组织，称重，放入匀浆器中，按比例加入组织蛋白裂解液，低温匀浆。4℃下12000 r/min离心15min，提取上清液。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒（Pierce Biotechnology公司，美国）测定总蛋白浓度。以GAPDH为内参进行电泳。电泳后，蛋白转印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，采用5%脱脂牛奶4℃过夜，封闭PVDF膜。山羊抗大鼠NR1多克隆抗体（1:1000，sc-1467，Santa Cruz公司，美国）、兔抗大鼠GluR1单克隆抗体（1:1000，ab109450，abcam公司，英国）及兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体（1:2000，北京康为世纪生物科技有限公司，中国）室温孵育2 h。TBS液洗涤PVDF膜，而后分别滴加结合兔抗山羊IgG二抗及山羊抗兔IgG二抗的辣根过氧化物酶（1:500，北京中杉金桥生物技术有限公司，中国），室温孵育1 h。TBS液洗膜，采用ECL试剂（Pierce,美国）显影。Image-ProPlus 6.0 s of tware（Media Cybernetics,美国）分析蛋白条带光密度值进行蛋白半定量分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计分析。所有大鼠糖水偏好百分比在建模前后的比较使用配对t检验，采用单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）比较各组大鼠糖水偏好百分比、逃避潜伏期及空间探索时间，两两组间比较采用Bonferroni法。检验水准α为0.05。

2 结果

表1 各组大鼠各时点糖水偏好实验及Morris水迷宫实验结果（±s）

表1 各组大鼠各时点糖水偏好实验及Morris水迷宫实验结果（±s）

1）与模型组比较，经Bonferroni检验，P＜0.01

处理后21.4±3.71)29.5±4.3 28.3±3.4组别电休克组氯胺酮组模型组n10 10 10糖水偏好百分比处理前62.0%±5.0% 65.2%±4.2% 66.1%±4.4%处理后78.5%±4.0%1)76.2%±4.3%1)65.3%±4.2%逃避潜伏期（s）处理前22.7±5.2 21.5±5.0 22.3±4.7处理后23.2±4.61)14.7±5.1 16.5±4.9空间探索时间（s）处理前22.5±4.2 22.4±3.9 23.7±3.8

建模后所有大鼠糖水偏好百分比（64.4%± 4.2%）较处理前（82.6%±4.9%）降低（t=-13.8，P＜0.01）。处理前，各组间糖水偏好百分比（F=3.08，P=0.07）、逃避潜伏期（F=1.64，P=0.64）、空间探索时间（F=0.16，P=0.85）差异无统计学意义。处理后，三组糖水偏好百分比有统计学差异（F=34.11，P＜0.01），电休克组（P＜0.01）、氯胺酮组（P＜0.01）相比模型组均升高；逃避潜伏期三组间差异有统计学意义（F=8.88，P＜0.01），其中电休克组比模型组延长（P=0.02），氯胺酮组与模型组无统计学差异（P=0.87）；空间探索时间三组间有统计学差异（F= 10.37，P＜0.01），电休克组比模型组缩短（P＜0.01），氯胺酮组与模型组无统计学差异（P=1.00），见表1。

GluR1表达量三组间有统计学差异（F=46.31，P＜0.01），与模型组相比，氯胺酮组（P＜0.01）和电休克组（P＜0.01）GluR1表达量增加。NR1表达量三组间有统计学差异（F=177.04，P＜0.01），电休克组NR1表达量低于氯胺酮组（P＜0.01）和模型组（P＜0.01）；氯胺酮组NR1表达量高于模型组（P＜0.01）。见表2与图1。

3 讨论

CUMS是抑郁症研究中广泛采用的建立抑郁大鼠模型方法。该法建立的抑郁模型大鼠表现抑郁症核心症状，即“快感缺失”，并且该抑郁模型大鼠对抗抑郁药物治疗及ECT治疗有良好的反应性[8]。本研究通过糖水偏好实验评估模型大鼠抑郁状态，CUMS建模后大鼠糖水偏好百分比明显降低，提示建模成功。

NMDA受体及AMPA受体均为多种亚基构成的多聚体。NMDA受体NR1亚基组成NMDA受体的离子通道，是构成NMDA受体的必备亚基[6]；而AMPA受体GluR1亚基是其主要组成亚基之一，也是参与突触可塑性的重要亚基，并且其参与突触可塑性的作用受NMDA受体介导的内流Ca2+所调控[9]。此外，NMDA受体和AMPA受体不仅参与突触可塑性和学习记忆功能，并且两种受体异常与神经精神疾病有关[6,10]，对此两种受体的不同影响可能是ECS和氯胺酮效应差异的机制。因此，本研究观察ECS和氯胺酮对此两种受体的作用，以探讨其抗抑郁效应的差异性。

表2 各组大鼠实验处理后海马区GluR1及NR1相对表达量（±s）

表2 各组大鼠实验处理后海马区GluR1及NR1相对表达量（±s）

1）与模型组比较，经Bonferroni检验，P＜0.01；2）与氯胺酮组比较，经Bonferroni检验，P＜0.01

组别电休克组氯胺酮组模型组n 5 5 5 GluR10.439±0.0321)0.424±0.0281)0.266±0.037 NR10.415±0.0311)2)0.772±0.0271)0.656±0.024

图1 抑郁大鼠海马区GluR1及NR1表达（western-blot法）

ECS和氯胺酮均上调GluR1的表达，这可能是其抗抑郁的共同机制之一。前期研究发现，ECS可以引起大鼠海马区突触增加，海马神经纤维增生及电生理的长时程增强（long-term potentiation，LTP）样作用[11-13]，其对突触结构及功能的增强作用与本研究结果一致。ECS对GluR1的上调作用可能与电刺激引起神经细胞LTP样改变有关。氯胺酮通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）促进神经细胞上调包括GluR1在内多种突触相关蛋白的转录表达，并且该效应在一定范围内呈剂量依赖性，上调GluR1表达及激活AMPA受体是氯胺酮抗抑郁机制之一[14-16]。

两者不同之处在于ECS同时下调NR1表达水平，而氯胺酮对NR1表达起上调作用。NMDA受体介导的内流Ca2+在突触可塑性中具有重要作用。研究指出，干扰神经细胞NMDA受体、细胞内游离Ca2+或Ca2+激活的蛋白激酶可影响突触可塑性[17-18]。故推测，ECS对学习记忆功能损害作用可能与其下调NR1表达，引起神经细胞兴奋时Ca2+内流减少而损害突触可塑性有关；而氯胺酮上调NR1表达，维持NMDA受体与AMPA受体平衡，故并不引起抑郁大鼠学习记忆功能损害。

NMDA受体是ECT和氯胺酮共同作用靶点，ECT和氯胺酮对NMDA受体的不同影响，可能与二者的作用机制差异有关。ECS作用时会引起包括海马区在内的大脑广泛区域神经细胞兴奋，使得谷氨酸瞬间大量释放。并且，研究表明谷氨酸持续作用会引起NMDA受体表达下调[6]。故ECS可能通过反复引起谷氨酸大量释放而导致NR1表达下调。不同的是，氯胺酮是NMDA受体的阻滞剂。并且，本研究前期发现，抑郁大鼠海马内谷氨酸含量高于正常大鼠[19]。推测氯胺酮可能通过阻滞谷氨酸受体而逆转高水平谷氨酸对NMDA受体表达的抑制作用而间接上调其表达水平。

本研究的主要不足之处在于实验未单独使用电休克或异丙酚处理大鼠，尚无法明确异丙酚对上述受体的影响。深入解释谷氨酸受体在电休克疗效及副作用中的作用机制，以及异丙酚等麻醉药的影响，尚需进一步研究。此外，本研究仅从现象上发现NMDA受体及AMPA受体在介导电休克或氯胺酮的抗抑郁疗效及学习记忆损害作用中可能发挥不同的作用，尚不能明确回答该两种受体的具体角色作用。

本研究从对NMDA受体及AMPA受体表达的不同影响探讨ECS及氯胺酮抗抑郁效应差异的机制。电休克及氯胺酮均能上调AMPA受体GluR1亚基表达，同时氯胺酮上调NMDA受体NR1亚基表达，而电休克下调NR1亚基表达。电休克及氯胺酮对抑郁大鼠抑郁行为及学习记忆功能影响的差异可能与其对NR1及GluR1亚基表达影响的不同有关。

[1] Pagnin D,de Queiroz V,Pini S,etal.Efficacy of ECT in depression:ameta-analytic review[J].JECT,2004,20(1):13-20.

[2] Zarate CA Jr,Singh JB,Carlson PJ,et al.A randomized trial of an N-methyl-D-aspartate antagonist in treatment-resistantmajor depression[J].Arch Gen Psychiatry,2006,63(8):856-864.

[3] 刘媛媛,闵苏,董军,等.无抽搐电休克对抑郁大鼠学习记忆功能的影响及其突触可塑性机制[J].中国神经精神疾病杂志,2010,36(2):70-74.

[4] McDaniel WW,Sahota AK,Vyas BV,et al.Ketamine appears associated with better word recall than etomidate after a course of 6 electroconvulsive therapies[J].J ECT,2006,22(2): 103-106.

[5] MacPherson RD,Loo CK.Cognitive impairment following electroconvulsive therapy--does the choice of anesthetic agent make a difference[J].JECT,2008,24(1):52-56.

[6] Lau CG,Zukin RS.NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders[J].Nat Rev Neurosci, 2007,8(6):413-426.

[7] Derkach VA,Oh MC,Guire ES,et al.Regulatory mechanisms of AMPA receptors in synaptic plasticity[J].Nat Rev Neurosci, 2007,8(2):101-113.

[8] Willner P.Validity,reliability and utility of the chronic mild stressmodel of depression:a 10-year review and evaluation[J]. Psychopharmacology(Berl),1997,134(4):319-329.

[9] Bassani S,Folci A,Zapata J,et al.AMPAR trafficking in synapse maturation and plasticity[J].Cell Mol Life Sci,2013,70 (23):4411-4430.

[10] Zarate CA Jr,ManjiHK.The role of AMPA receptormodulation in the treatment of neuropsychiatric diseases[J].Exp Neurol, 2008,211(1):7-10.

[11] Gombos Z,Spiller A,Cottrell GA,et al.Mossy fiber sprouting induced by repeated electroconvulsive shock seizures[J].Brain Res,1999,844(1-2):28-33.

[12] Stewart C,Jeffery K,Reid I.LTP-like synaptic efficacy changes following electroconvulsive stimulation[J].Neuroreport,1994,5 (9):1041-1044.

[13] Chen F,Madsen TM,Wegener G,et al.Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus[J].Eur Neuropsychopharmacol,2009,19 (5):329-338.

[14] Li N,Lee B,Liu RJ,et al.mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NM D Aantagonists [J].Science,2010,329(5994):959-964.

[15] 余海鹰,高志勤,杨春,等.不同剂量氯胺酮的抗抑郁作用及其与海马mTOR及GluR1的关系[J].中国神经精神疾病杂志,2012,38(3):169-172.

[16] 杨春,李文媛,张广芬,等.AMPA受体介导氯胺酮抗抑郁大鼠海马BDNF及TrkB变化[J].临床麻醉学杂志,2011,27 (11):1101-1103.

[17] Hayashi Y,Shi SH,Esteban JA,et al.Driving AMPA receptors into synapses by LTP and CaMKII:requirement for GluR1 and PDZ domain interaction[J].Science,2000,287(5461): 2262-2267.

[18] Harney SC,Rowan M,Anwyl R.Long-term depression of NMDA receptor-mediated synaptic transmission is dependent on activation ofmetabotropic glutamate receptors and is altered to long-term potentiation by low intracellular calcium buffering [J].J Neurosci,2006,26(4):1128-1132.

[19] 刘永峰,闵苏,董军,等.异丙酚预先给药对抑郁大鼠电休克后海马Glu和GABA水平的影响[J].中华麻醉学杂志, 2009,29(2):121-124.

R749.4

A

2014-03-18）

（责任编辑：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.09.010

☆国家自然科学基金面上项目（编号：81271501）；国家临床重点专科建设项目经费资助（编号：财社(2011)170号）；重庆市重点学科建设项目经费资助（编号：渝卫科教(2007)2号）

*重庆医科大学附属第一医院麻醉科（重庆 400016）