淀粉对高山被孢霉产花生四烯酸的影响

王文翔，王 澍，佘 隽，田 华，陈 涛，何东平

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北武汉430023;2.武汉博特尔油脂科技有限公司，湖北武汉430040;3.中国科学院武汉病毒研究所，湖北 武汉430060)

花生四烯酸(Arachidonic Acid，简称 ARA，下同)的中文全称为 5，8，11，14-二十碳四烯酸，是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广的一种多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid，简称 PUFA，下同)，属n－6系列，简记为C20:4(n－6)，结构式如图1所示。

图1 花生四烯酸的结构式

ARA在人体内不能自行合成，但对人体的生命活动必不可少，它是细胞膜的重要成分，在维持细胞膜的结构与功能上发挥着重要的作用;也是人体前列腺素合成的前体物质，对人体的生理功能有着重要的调节作用。研究发现，ARA还有着保护皮肤、降低胆固醇、抑制血小板聚集、提高免疫能力、促进胎儿发育等［1－2］独特的生理功能。目前，ARA主要来源于动物肝脏、鱼油、猪肾上腺等，但其含量都很低，不能满足市场需求，也难以实现工业化生产。

微生物发酵法是生产ARA的新途径［3］，不受原料、气候和产地等的限制，具有生长周期短，培养方法简单，产品质量稳定等优点，易于规模化和产业化，引起了国内外研究人员的广泛关注［4－8］。从菌种安全性考虑，高山被孢霉(Mortierella alpina)属于接合菌纲毛霉目被孢霉科被孢霉属［9］，无变应原性和毒性［10－11］，在摇瓶发酵培养时，菌体内会逐步累积油脂，且ARA含量较高，因此利用其生产花生四烯酸是可行的。

培养基对高山被孢霉产ARA有着十分重要的影响，其组成主要包括碳源、氮源和无机盐等。传统的碳源主要是葡萄糖，鉴此，笔者以实验室保藏的ARA菌株Mortierella alpina 200012201－12－2－2(简称12－2－2，下同)为出发菌株，采用添加淀粉的方法，通过测定糖氮代谢曲线，以生物量、含油率和ARA产量为综合评价指标，研究其对高山被孢霉产ARA的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

SW－CJ－1F单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司;YM75立式压力蒸汽灭菌器:上海三申医疗器械有限公司;HYQ－150S全温摇床，武汉汇诚生物科技有限公司;K9840自动凯式定氮仪，山东济南海能仪器有限公司;XSP－BM－2CA生物显微镜，上海光学仪器厂;SPX－150C恒温恒湿培养箱，常州中捷实验仪器制造有限公司，SK3300LHC超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司;GZX－9070 MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TSZ5－WS小型台式高速冷冻离心机，湖南长沙平凡仪器仪表有限公司;SP－2560气相色谱仪，安捷伦科技有限公司;索式抽提器和旋转蒸发仪，武汉集思仪器设备有限公司。

1.2 菌株

高山被孢霉突变株12－2－2，由本实验室通过60Co－γ射线辐照诱变选育所得。冰箱中4℃条件下PDA斜面保藏，每隔3个月传代一次。

1.3 培养基

PDA培养基:马铃薯(250 g/L)的浸出液，葡萄糖20 g/L，琼脂 20 g/L，pH自然，115℃灭菌 25 min。

种子培养基:葡萄糖30 g/L，酵母膏10 g/L，MgSO40.1 g/L，KH2PO40.1 g/L，pH 6.5—7.5，500 mL三角瓶装液100 mL，115℃灭菌25 min。

对照组发酵培养基:葡萄糖60 g/L，酵母膏20 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH6.5—7.5，500 mL三角瓶装液100 mL，115℃灭菌25 min。

实验组发酵培养基:葡萄糖60 g/L，淀粉20 g/L，酵母膏 20 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，pH6.5—7.5，500 mL 三角瓶装液 100 mL，115℃灭菌25 min。

1.4 培养方法

1.4.1 菌株活化

将冰箱中PDA斜面保藏的高山被孢霉突变株12－2－2转接到PDA平板上于26℃培养4—5 d，活化。

1.4.2 种子培养

用灼烧后的无菌环挑取少许经活化后的菌丝，转接于种子培养基中，在26℃，180 r/min的条件下，培养3 d。

1.4.3 发酵培养

用灭过菌的吸管吸取10 mL种子液，转接于发酵培养基中，在26℃，180 r/min的条件下，培养8 d。

1.5 分析方法

1.5.1 平板观察

挑取活化后长势良好的平板，观察其形态特征。

1.5.2 显微镜观察

分别挑取长势良好的对照组和实验组的发酵瓶菌丝体，涂片，用显微镜观察两组菌丝体形态上的不同特征，并拍照。

1.5.3 糖氮代谢曲线的测定

发酵液经2 000 r/min离心10 min，取上层液2 mL至50 mL容量瓶，蒸馏水稀释定容，糖耗采用蒽酮—硫酸法［12］，氮耗采用凯式定氮法［13］，每隔 24 h测定一次，连续测定8 d。

1.5.4 生物量的测定

取一块干净的纱布，过滤已培养8 d的发酵液，经蒸馏水洗涤两次后，将收获的菌丝体于60℃烘箱中烘至恒重，称量并计算生物量。

1.5.5 含油率的测定

干菌体研钵磨成粉末后采用Soxhlet法［13］提取油脂，并计算其得率。

1.5.6 ARA 含量的测定

取菌体油脂0.1 g加2 mL3%KOH-甲醇溶液，75℃振荡15 min水解。水解后，加2 mL 14%三氟化硼—甲醇溶液，于70℃振荡2 min甲酯化。然后，加2 mL饱和 NaCl溶液分层，最后加正己烷1 mL，振荡取上清液进样。

色谱柱 SP-2560，载气为氮气/空气，分流比15∶1，进样口温度250℃，FID2检测器温度260℃，压力2.4 kPa，进样量1μL，根据峰面积和标准工作曲线计算ARA含量。

2 结果与分析

2.1 菌丝体形态

由图2可见，在摇瓶中发酵培养后，对照组的菌丝体呈细丝状分布，膨大鼓起的部位较少且不明显;而实验组的菌丝体呈藕节状分布，膨大鼓起的部位较多且很明显。据此可以初步判断，淀粉的添加对高山被孢霉菌丝的生长和油脂的累积有一定的促进作用，其菌丝生长的更为粗壮，膨大端更为明显，菌丝体内透明的油滴状物质更多，油脂含量更高。

图2 对照组(左)与实验组(右)的菌丝体形态

2.2 糖代谢曲线

由图3可得，不论是对照组还是实验组，糖耗在第1天到第3天都是逐渐增大，在第3天分别达到了16.01 g/L和24.54 g/L;而到了第4天，糖耗出现了骤升，分别为35.21 g/L和44.67 g/L。第4天之后，对照组和实验组的糖耗又继续逐渐增大，直至第8天达到一个相对稳定的状态，分别为57.01 g/L和59.37 g/L。因为实验组最终稳定的糖耗只比对照组略高，可初步推断淀粉被分解吸收的很少，其充当碳源的作用没有葡萄糖明显。

图3 对照组与实验组的糖代谢曲线

由图3也可发现对照组和实验组的糖代谢曲线有着明显的差别:虽然其在第7天稳定后的糖耗差别不大，但第1天到第6天，实验组的糖耗都要高于对照组。据此可以初步判断，淀粉的添加虽然对高山被孢霉摇瓶发酵时的最终糖耗没有明显的影响，但会影响糖消耗的速率，添加淀粉之后，糖的消耗速率有了明显的增大，更快地达到了稳定。

2.3 氮代谢曲线

由图4可见，不论是对照组还是实验组，第1天到第3天的氮耗速率都要大于第4天到第8天。第1天到第3天，氮耗逐渐增大，在第3天分别为16.41g/L和17.95 g/L;第4天之后，氮耗速率明显减小，到第7天已基本趋于稳定，分别为19.31 g/L和 19.85 g/L。

图4 对照组与实验组的氮代谢曲线

另外，对照组和实验组的氮代谢曲线也有较大的差别:第1天到第8天，实验组的氮耗速率都比对照组要大，直至最后趋于稳定。据此可以初步推断，淀粉的添加对高山被孢霉摇瓶发酵时的氮代谢过程也有一定的影响，添加淀粉之后，虽然其最终氮耗没有明显的变化，但氮的消耗速率有了一定的增大。

2.4 生物量、含油率和ARA产量

对照组和实验组的生物量、含油率和ARA产量见表1。

表1 对照组与实验组的生物量、含油率和ARA产量

由表1可得，实验组的生物量、含油率和ARA产量都要明显高于对照组，分别达到了30.57 g/L，41.16%和4.65 g/L。据此可以判断，淀粉的添加对高山被孢霉产花生四烯酸有明显的影响，生物量、含油率和ARA产量在添加淀粉后都有明显的增大。

综合菌丝体形态和糖氮代谢过程，产生这种现象的可能原因是淀粉是一种固形物，虽然在摇瓶发酵的过程中充当碳源的作用很微弱，没有葡萄糖明显，但其添加使得菌丝体在生长时有了附着物，生长的更为分散，更不容易聚集成团，与周围营养成分的接触面积也就增大了。在发酵培养初期，实验组能够更好地吸收氮源，菌丝体生长的更为迅速和粗壮，生物量增大;发酵培养中后期，实验组能更为高效的吸收碳源，代谢活动更为旺盛，代谢产物积累的速率加快，其油脂产量和ARA产量也随之增大了。

3 结论

淀粉对高山被孢霉产花生四烯酸有促进作用。在发酵培养基中添加2%的淀粉后，生物量、含油率和 ARA 产量各为 30.57 g/L，41.16% 和 4.65 g/L，分别是未添加淀粉的1.09倍，1.18倍和1.53倍。淀粉充当碳源的作用很微弱，没有葡萄糖明显，但其作为一种固形物起到了菌丝体生长附着物的功能，使菌丝体在生长时分散开来，更不容易聚集成团，有益于菌丝体对周围营养成份的吸收，代谢产物的积累速度和积累量也随之增大。随着研究工作的继续深入，优化培养及发酵技术的成熟，高山被孢霉产花生四烯酸的生物量、含油率和ARA产量均有较大的提升可能性。

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