猪血红蛋白酶解液脱色工艺研究

蔡红燕，刘 英，陈石良

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉430023;2.湖北奥彤生物制品科技有限公司，湖北孝感432600)

猪血红蛋白含有丰富的蛋白质和血红素。血红蛋白经蛋白酶水解后可以将其分解为小分子肽，这些小分子肽类消化吸收快，且具有多种生物活性［1-2］。虽然经过酶解，血红蛋白的功能特性及消化吸收率得到了提高，但在酶解过程中，由于呈色物质血红素的存在，致使最终产品呈黑褐色，即使在食品中添加的量很少，也会影响整个食品的色泽，这极大地限制了血红蛋白酶解产物的应用。因此，研究血红蛋白酶解液的脱色方法是极其必要的。

目前，血红蛋白酶解液脱色的方法有物理法、化学法和酶解法［3-5］，其中活性炭吸附法是最常见的一种物理脱色方法。但单纯使用活性炭吸附法也存在一些问题，比如活性炭用量大，再生困难，吸附有效成分多，血红素回收困难等。因此，血红蛋白酶解液脱色的方法还需进一步研究。

笔者研究传统的活性炭吸附法与pH沉降—活性炭吸附法对血红蛋白酶解液脱色的影响，比较两种脱色方法的工艺参数，探讨最佳的脱色方法，为血红蛋白肽的纯化及工业化生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

猪血红蛋白酶解液，自制。蛋白酶，广州诺维信公司提供。

1.2 主要仪器及设备

KDN-103F自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司;754紫外可见分光光度计，上海现科分光仪器有限公司;DL7M台式离心机，长沙湘智离心机仪器公司;HH恒温水浴锅，江苏中大仪器厂;PHS-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司。

1.3 测定方法

蛋白质含量的测定方法为GB 5009.5-2010;灰分含量的测定方法为GB 5009.4-2010。

1.4 酶解液的制备

酶解液的制备工艺如图1所示。

图1 酶解液的制备工艺

1.5 脱色工艺条件的研究

1.5.1 活性炭吸附法脱色工艺参数的研究

将酶解液稀释5倍后取50 mL稀释液，加入活性炭脱色，吸附完成后过滤，滤液在385 nm处测定吸光值［6］，吸光值越小说明脱色效果越好。分别研究脱色的 pH 值(3，3.5，4，4.5，5)、温度(30 ℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃)、活性炭用量(1%，2%，3%，4%，5%)及脱色时间(20 min，40 min，60 min，80 min，100 min)对血红蛋白酶解液脱色效果的影响，确定活性炭吸附法的最佳工艺参数。

1.5.2 pH沉降—活性炭吸附法工艺参数研究

分别取酶解液 50 mL，调节 pH 值到 5.8，6.8，7.8，沉降离心后观察酶解液的颜色，确定沉降的pH值。

将酶解液的pH值调到5.8，沉降离心后取上清液50 mL，加入活性炭脱色，脱色后过滤，滤液在385 nm处测定吸光值，分别研究温度(15℃，25℃，35℃，45 ℃，55 ℃)、活性炭添加量(0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%)及时间(0 min，15 min，30 min，45 min，60 min)对酶解液脱色的影响，确定最佳的工艺参数。

2 结果与分析

2.1 活性炭吸附法脱色工艺的研究

2.1.1 pH值对活性炭脱色效果的影响

由图1可以看出，随着pH值的升高，酶解液的吸光值先降低后升高。当pH值由3升高到4.5时，吸光值逐渐降低，当pH值由4.5上升到5时，吸光值急剧增加。pH值为4.5时吸光值最低，说明此时活性炭的脱色效果最佳，这可能与蛋白质的等电点有关。所以脱色的最佳pH值为4.5。

图1 pH值对活性炭脱色效果的影响

2.1.2 温度对活性炭脱色效果的影响

由图2可知，随着活性炭脱色温度的升高，酶解液的吸光值逐渐降低。当温度由30℃上升到70℃时，吸光值迅速降低，而当温度由70℃上升到80℃时，吸光值变化不明显，说明再升高温度对活性炭的脱色效果影响不大，所以活性炭脱色对的最佳温度为70℃。

图2 温度对活性炭脱色效果的影响

2.1.3 活性炭用量对活性炭脱色效果的影响

如图3所示，酶解液的吸光值随着活性炭用量的增加而降低，说明活性炭用量的增加有利于脱色效果的提高。当活性炭用量由1% 增加到3%时，吸光值降低明显，而当活性炭用量由3%增加到5%时，吸光值降低缓慢。虽然活性炭用量的增加会提高脱色的效果，但增大活性炭用量的不但增加了生产成本，同时还会吸附酶解液中的蛋白质，所以活性炭的用量并不是越多越好。综合考虑脱色效果、经济效益和有效成分的损失，活性炭脱色的最佳用量为3%。

图3 活性炭用量对活性炭脱色效果的影响

2.1.4 脱色时间对活性炭脱色效果的影响

由图4可知，酶解液的吸光值随着活性炭脱色时间的延长而逐渐降低。前60 min吸光值降低得较快，脱色效果明显。60 min以后，继续延长脱色时间，酶解液的吸光值变化较为缓慢，说明此时活性炭的吸附能力已接近饱和。且当脱色时间达到60 min时，酶解液的色泽已经比较浅，已达到了脱色的目的。所以脱色时间选择60 min。

图4 脱色时间对活性炭脱色效果的影响

2.2 pH沉降—活性炭吸附法工艺参数的研究

2.2.1 沉降pH值的选择

分别取50 mL酶解液，调节pH值为7.8(酶解液原始 pH 值约为7.8)，6.8 及5.8，沉降离心后观察溶液颜色的变化，其结果见表1。

表1 沉降pH值对脱色效果的影响

当血红蛋白酶解液的pH值为7.8时，酶解液为黑褐色。当pH降低到6.8时，酶解液中虽然有少量沉淀产生，但酶解液的颜色依然是黑褐色。但当pH值降低到5.8时，酶解液中产生大量沉淀，沉降离心后，可以得到金黄色透明的溶液，此时，酶解液的色泽已发生了质的变化。若继续降低pH值，虽然可以去除更多的呈色物质，但也会增加生产过程中酸和碱的用量，同时还会增加产品中的盐分，影响产品质量。所以沉降时最佳的pH值为5.8。

2.2.2 脱色温度对脱色效果的影响

由图5可知，随着温度的增高，吸光值逐渐降低。当温度由15℃上升到35℃时，吸光值降低迅速，脱色效果明显。但当温度由35℃增加到55℃时，吸光值降低缓慢，脱色效果增加并不明显。这可能是因为酶解液中大部分色素已被吸附的缘故。所以吸附时的最佳温度为35℃。

图5 脱色温度对pH沉降—活性炭吸附法脱色效果的影响

2.2.3 活性炭用量对脱色效果的影响

由图6可以看出，酶解液的吸光值随着活性炭用量的增加逐渐减小。当活性炭用量由0.5%增加到1.5%时，吸光值降低明显。但当活性炭用量由1.5%增加到2.5%时，吸光值降低缓慢。综合考虑脱色效果、经济效益和有效成分的损失，活性炭最佳的用量为1.5%。

图6 活性炭用量对pH沉降—活性炭吸附法脱色效果的影响

2.2.4 脱色时间对脱色效果的影响

由图7可以看出，随着脱色时间的延长，酶解液的吸光值先急剧降低，当时间超过15 min后，吸光值降低缓慢，这可能是因为酶解液中大部分呈色物质已被吸附的缘故。综合考虑脱色效果和生产效率，选择脱色时间为15 min。

图7 脱色时间对pH沉降—活性炭吸附法脱色效果的影响

2.3 两种脱色方法的比较

将酶解液分别用两种不同的方法脱色，脱色后调节pH值到中性，冷冻干燥后测定产品中蛋白质及灰分的含量，其结果见表3。两种脱色方法工艺参数的比较如表3所示。

表2 两种脱色方法产品质量指标的比较

表3 两种脱色方法工艺参数的比较

结合表2和表3可以看出，采用pH沉降—活性炭吸附法较传统的活性炭吸附法有较多的优点。pH沉降—活性炭吸附法只需将pH值调到5.8，操作过程中节约了酸碱的使用量，使得产品中盐分含量大大降低。同时沉降离心后的沉淀中含有大量的血红素，此时因为还没有添加活性炭，血红素可以直接得到利用。此外，pH沉降—活性炭吸附法较活性炭吸附法脱色温度低，活性炭用量少，且脱色时间短，这不断节约了生产成本，提高了生产效率，而且还提高了产品的质量。采用pH沉降—活性炭脱色法得到的产品中蛋白质的含量可提高到85.60%，灰分含量可降低到4.51%。

3 结论

(1)活性炭吸附法脱色的最佳工艺为:pH值为4.5，脱色温度为70℃，活性炭用量为3%，脱色时间为60 min。

(2)pH沉降—活性炭吸附法脱色的最佳工艺为:沉降pH值为5.8，脱色温度为35℃，活性炭用量为1.5%，脱色时间为15 min。

(3)pH沉降—活性炭吸附法生产成本低，生产效率高，产品质量好，是一种较为理想的脱色方法。

［1］Nedjar-Arroume N，Dubois-Delval V，Miloudi K，et al.Isolationand characterization of four antibacterial peptides from bovine hemoglobin［J］.Peptides，2006，27(9):2082-2089.

［2］Chang C Y，Wu K C，Chang SH.Antioxidant properties and protein compositions of porcine hemoglobin hydrolysates［J］.Food Chemistry，2007，100(4):1537-1543.

［3］于美娟，马美湖.畜禽血液的脱色技术研究进展［J］.肉类工艺，2004(10):24-28.

［4］于美娟，马美湖，单杨，等.猪血红蛋白酶解液脱色技术研究［J］.肉类工业，2006(8):30-34.

［5］周庆，刘学文，张欣.酶解猪血制备血球蛋白粉的脱色工艺研究［J］.食品与机械，2009，25(4);89-91.

［6］于长青，任泊晓，修峰.鹅血酶解液活性炭脱色效果的研究［J］.中国食品添加剂，2007(1):66-69.