三甲散对HSC-T6细胞α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ蛋白表达的影响*

郑旭锐，惠 毅，闫曙光，宋 逍，曹 宁，王礼凤，晁 旭

（陕西中医学院，咸阳 712046）

三甲散对HSC-T6细胞α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ蛋白表达的影响*

郑旭锐，惠 毅，闫曙光，宋 逍，曹 宁，王礼凤，晁 旭

（陕西中医学院，咸阳 712046）

[目的]检测三甲散含药血清对肝星状细胞株（HSC-T6）细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶抑制-1（TIMP-1）和蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）的表达，从而研究三甲散对HSC-T6细胞增殖作用的影响。[方法]以三甲散含药血清干预HSC-T6细胞，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫印迹（Western blot）技术，检测三甲散含药血清对HSC-T6细胞中α-SMA、TIMP-1和ROCK-Ⅰ的蛋白表达。[结果]三甲散和Y-27632显著地降低了HSC-T6细胞α-SMA、ROCK-Ⅰ和TIMP-1 mRNA和蛋白的表达。[结论]三甲散可降低HSC-T6细胞ROCK-Ⅰ蛋白、TIMP-1和α-SMA的表达,从而抑制HSC-T6细胞的增殖。

三甲散；α-SMA；TIMP-1；ROCK-Ⅰ；蛋白表达

肝纤维化是指肝细胞发生炎症刺激或坏死时，各种致病因子致肝脏中细胞外基质（ECM）增生和降解之间失去应有的平衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积、肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，其进一步发展即可以导致肝硬化、肝癌。据资料统计，中国约有3 000万慢性肝炎患者，其中约有20%～40%可发展为肝硬化乃至肝细胞癌[1]。肝星状细胞（HSC）是肝脏细胞外基质的主要细胞来源，是肝纤维化形成的细胞学基础。细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）可作为HSC活化的标志。基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）是组织型基质金属蛋白酶抑制因子（TIMPs）家族中作用最强的成员，为促纤维化因子[2]。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）是由属于小G蛋白超家族的Rho小G蛋白激活的，它可以调节肝星状细胞的多种生物学行为，包括表型、运动、生长分裂、凋亡、基因表达等，从而激活肝纤维化发生的中心环节。三甲散源自明代末年著名温病学家吴又可的著作《温疫论》，其具有融滋阴、活血、行气、逐瘀的作用，对邪正交灼而成久病入络的痼疾颇为适宜，近年来三甲散日益受到现代医家的关注[3-7]，本研究拟从三甲散对HSC-T6细胞Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（ROCK-Ⅰ）、TIMPs和细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。初步揭示三甲散抗肝纤维化的作用机制。

1 实验材料

三甲散药液：由鳖甲、龟甲、穿山甲、地鳖虫、生牡蛎、白僵蚕、白芍、当归、甘草组成，以上药物均购自陕西中医学院第一附属医院中药房，药物加水浸泡常规煎煮、过滤，水浴蒸发浓缩至每毫升含生药3.5 g。三甲散按10 mL/kg药液经胃灌药，1次/d，连续灌胃7 d，最后1次灌药（灌药前应禁食不禁水12 h）1 h后，腹主动脉采血，离心分离血清，56℃水浴中灭活30 min，0.44 μm微孔滤膜过滤，-20℃冷藏备用。Y-27632（美国ALEXIS公司），大鼠肝星状细胞株HSCT6（购自上海肯强仪器有限公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），引物由宝生物工程（大连）有限公司设计合成，Trizol regeant（美国Invitrogen公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养方法 HSC-T6细胞接种在100 mL的培养瓶中（按1×105个/cm2），之后用DMEM培养液（含10%胎牛血清、100 U/mL链霉素和100 U/mL青霉素）培养，在饱和湿度为5%，温度为37℃的二氧化碳（CO2）恒温培养箱中进行培养。根据HSC-T6细胞生长、增殖情况及时更换培养液（周期约为每2～3 d 1次）。

2.2 细胞传代方法 选择对数生长期的HSC-T6细胞，细心吸去培养液，再加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化3 min，加入DMEM[含10%胎牛血清（FBS）]培养液，轻轻吹打培养瓶的瓶壁，收集细胞悬液后离心5 min（1 000 g），弃去上清液后加入DMEM培养液含10%FBS重悬，之后以5×104个/cm2接种。

2.3 实验分组 实验分组为：空白对照组（DMEM培养液＋HSC-T6细胞），三甲散组（DMEM培养液＋HSC-T6细胞＋6 mmol/L三甲散），Y-27632阳性对照组（DMEM培养液＋HSC-T6细胞＋10μmol/L Y-27632）。

2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法和免疫印迹（Western blot）法检测α-SMA、ROCK-Ⅰ、TIMP-1mRNA和蛋白的表达 RT-PCR法按照试剂盒说明书进行，Western blot检测时先用细胞裂解液裂解细胞后用BCA法检测蛋白浓度，在-70℃冻存后再按试剂说明书进行。

2.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，单因素方差分析及SNK检验，结果用均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

RT-PCR结果显示，与对照组相比，三甲散和Y-27632甙作用24 h后，HSC-T6细胞中α-SMA、ROCK-I及TIMP-1mRMA表达均降低（P＜0.01），见图1。Westernblot结果亦显示，与对照组相比，三甲散和Y-27632甙作用24 h后，HSC-T6细胞中α-SMA、ROCK-I及TIMP-1蛋白表达均降低（P＜0.05），见图2、图3。

4 讨论

图1 三甲散和Y-27632对HSC-T6细胞α-SMA、ROCK-I、TIMP-1mRMA相对表达水平

目前研究认为，HSC的激活是肝纤维化形成的中心环节[8]，α-SMA蛋白可以作为HSC活化的标志。TIMP-1为促纤维化因子，是TIMPs家族中作用最强的成员[9]。ROCK-Ⅰ是由属于小G蛋白超家族的Rho小G蛋白激活的，其与α-SMA、TIMP-1同为肝纤维化过程中HSC激活不可缺少的成员。近年来研究表明，Rho/ROCK信号通路参与了肝纤维化的形成过程，它可以调节HSC的多种生物学行为，从而激活HSC，形成肝纤维化的中心环节，在HSC的活化中扮演了非常重要角色[10-15]。

图2 三甲散和Y-27632对HSC-T6细胞α-SMA、ROCK-I及TIMP-1蛋白表达的影响

图3 三甲散和Y-27632对HSC-T6细胞α-SMA、ROCK-I、TIMP-1蛋白相对表达水平

三甲散方来源于明代著名的温病学家吴又可的著作《温疫论》。在《温疫论·主客交》中这样写道：“补之则邪火愈炽，泄之则损脾坏胃，滋之则胶邪愈固，散之则经络益虚，疏之则精气愈耗，守之则日消近死……所谓客邪胶固于血脉，主客交浑，最难得解，且愈久愈固，治法当乘其大肉未消，真元未败，急用三甲散，多有得生者。”[16]此处所说的“主”是指正气、气血，“客”指外来的邪气。“主客交”的意思是指素体正气已经虚衰，阴精耗竭非常严重，客邪留恋不去，正气虚弱不能逐邪外出，客邪不得从外解，与虚竭之营血相互胶结留滞于血脉而成的一种顽固变证。与虚、瘀、毒互结，痹阻络脉的络病实质基本相同，因此，“主客交”的核心在于络病阴伤，其中气滞血瘀痰凝又是络病的基本病理变化[17-18]。吴又可所说的三甲散是治疗“主客交”的主要方剂，方中的药物主要有鳖甲、龟甲、地鳖虫、生牡蛎、穿山甲、白僵蚕、白芍、当归、甘草。其中的鳖甲、龟甲中医学认为其是属于血肉有情之品，它们既可以驱逐阴分之邪，又可以滋养身体的精血；牡蛎、白僵蚕、穿山甲、地鳖虫以入络搜邪散结；方中的当归、白芍、甘草主要起益气养血的作用，这些药物合用共奏软坚散结、养肝通络之功。综观全方具有融滋阴、行气、活血、逐瘀的作用，对久病入络，邪正交浑而成的痼疾非常适宜。

实验结果发现，三甲散可以降低α-SMA mRMA与蛋白表达，ROCK-I、TIMP-1的mRMA与蛋白表达也均降低。其抗纤维化的作用机制很可能是通过抑制HSC-T6细胞增殖活化、降低α-SMA mRMA与蛋白表达，ROCK-I、TIMP-1的mRMA与蛋白表达来实现的，值得进一步的研究探讨。

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Effect of Sanjia powder on expression of protein of α-SMA,TIMP-1,ROCK-Ⅰin hepatic stellate cell

ZHENG Xu-rui,HUI Yi,YAN Shu-guang,SONG Xiao,CAO Ning,WANG Li-feng,CHAO Xu
（Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China）

[Objective]The expression of α-SMA,TIMP-1 and ROCKⅠin the hepatic（HSC-T6）stellate cell were measured to study the proliferating effect of Sanjia powder.[Methods]HSC-T6 cells interfered by Sanjia powder-containing serum,RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of α-SMA,TIMP-1,ROCKⅠin the hepatic stellate cell.[Results]Real-time PCR and Western blot assay showed that Sanjia powder and Y-27632 could reduce the expression of ROCK-Ⅰprotein,TIMP-1 and a-SMA mRNA in HSC-T6 cells.[Conclusion] Sanjia powder can decrease the expression of ROCK-Ⅰprotein,TIMP-1 and a-SMA in HSC-T6 cells.

Sanjia powder；α-SMA；TIMP-1；ROCK-Ⅰ；protein expression

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0359-03

2014-08-16）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.11

陕西省科技厅资助项目（2013JQ4007）。

郑旭锐（1976-），女，博士，主要从事中医药防治感染性疾病工作。