高效液相色谱法测定菟丝子中绿原酸、对-香豆酸和金丝桃苷的含量*

田雨霏，刘 姣，李 晋，马 琳，何 俊，刘二伟，常艳旭

（天津中医药大学天津市现代中药重点实验室，天津 300193）

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高效液相色谱法测定菟丝子中绿原酸、对-香豆酸和金丝桃苷的含量*

田雨霏，刘 姣，李 晋，马 琳，何 俊，刘二伟，常艳旭

（天津中医药大学天津市现代中药重点实验室，天津 300193）

[目的]建立同时测定菟丝子中绿原酸、对-香豆素和金丝桃苷的含量的高效液相色谱法，为菟丝子的质量标准建立提供依据。[方法]色谱柱为依利特ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.05%甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为360 nm。[结果]在此色谱条件下，3种成分可完全分离。绿原酸、对-香豆素和金丝桃苷的线性分别为2.00～100 μg/mL（r=0.999 3），6.25～100 μg/mL（r=0.999 1），0.50～50 μg/mL（r=0.999 1）。平均回收率分别为100%（RSD=3.2%）、102%（RSD=1.7%）和102%（RSD=3.1%）。[结论]该方法简便可行，重复性好，可用于菟丝子的质量评价。

菟丝子；高效液相色谱法；绿原酸；对-香豆素；金丝桃苷

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子（Cuscuta australis R.Br.）或菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）的干燥成熟种子[1]。它除作为临床常用中药外[2]，还是制药和保健品生产的重要原料药材之一。近年来国内外学者对菟丝子药理活性进行系统的研究发现，不仅具有补阳益阴、固精缩尿、明目止泻的传统功效，同时，具有生殖保护、抗衰老、免疫调节、改善心脑血管、保肝、降血糖、骨损伤修复，治疗白癜风等作用[3-5]。

菟丝子的化学成分种类较多，有黄酮类、多糖、香豆精、胆甾醇、有机酸等，其中绿原酸具有显著的清热抗菌、抗病毒的作用[6]，对-香豆素具有抗菌抗癌的功效[7]，金丝桃苷具有镇痛，保护心肌和肝脏等作用[8]。目前，菟丝子中黄酮类或其他少数成分的含量测定均有报道[9-15]，但是绿原酸、对-香豆素和金丝桃苷同时测定方法未见报道。本研究建立了同时测定菟丝子中绿原酸、对-香豆素和金丝桃苷3种成分的含量的高效液相色谱法（HPLC），为有效地控制菟丝子的质量提供依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 样品来源 本实验收集了9个不同地区（天津、内蒙古、陕西、新疆、河南、山西、重庆、云南和上海）的药房的正品菟丝子样品，经天津中医药大学马琳教授鉴定为菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.）。

1.2 仪器和试剂 美国Agilent 1100 Series液相色谱仪（Agilent二元泵，Agilent紫外检测器，G1312A自动进样器，Agilent1100色谱工作站）；BP121S万分之一天平（德国赛托利斯公司）；XW-80A微型涡旋混合仪（上海沪西仪器厂有限公司）；KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-5-B型台式低速离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；电热真空干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司）；MODEL2-16高速离心机（TOMOS）；202-O型台式干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）。甲醇为色谱纯(康科德)，水为超纯水（Milli-Q），甲酸（Tedia）。绿原酸购自中国药品生物制品检定所，金丝桃苷购自天津市药品生物制品检定所，对-香豆酸购自成都曼斯特生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：依利特ODS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A：甲醇；B：0.05%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～15 min，5%～30%A，15～45 min，30%～60%A，平衡5 MIN；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；进样量：10 μL；柱温：25℃。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密称取干燥的菟丝子药材粉末（过80目筛）0.10 g，精密称定，置磨口三角瓶中，加10 mL 50%甲醇，密塞，称质量，超声处理30 min，冷却，静置，称质量，补足减失的质量，作为供试品溶液。

1.3.3 对照品溶液的制备 分别取绿原酸、对-香豆酸和金丝桃苷对照品适量于容量瓶，精密称定，用50%甲醇配成不同浓度的对照品母液，涡旋，并于4℃保存。

2 结果及讨论

2.1 样品提取条件的优化 本研究考察了不同的提取方法（超声、加热回流），结果表明，50%甲醇超声提取的3种成分含量较高，因此，选择50%甲醇超声30 min为样品提取条件。

2.2 色谱条件的优化 在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水、甲醇-0.05%甲酸等不同体积分数、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱实验。结果表明，用甲醇-0.05%甲酸进行梯度洗脱为佳，加入一定比例的甲酸，能够改善各峰间的分离状况和峰形；使用梯度洗脱，可缩短样品分析时间，保证基线平稳，有利于被检测物的分析。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系的考察 分别准确称取对照品储备液适量，用甲醇稀释，制得绿原酸，对-香豆酸和金丝桃苷的混合对照品溶液，并逐级稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，按上述色谱条件测定，以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算。结果表明，绿原酸，对－香豆酸和金丝桃苷的标准曲线分别为Y＝2 000.9X＋11 850（r＝0.999 3）、Y＝1 929.9X＋1 418.3（r＝0.999 1）、Y＝5 016.1X＋29 812（r＝0.999 1），线性范围分别为2.00～100、0.50～50和6.25～100 μg/mL。

2.3.2 精密度实验 取同一供试品溶液，连续进样6次，测定其浓度，计算相对标准偏差。结果表明，绿原酸、对-香豆酸和金丝桃苷的RSD分别为2.4%、3.0%和1.0%，表明进样和仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性实验 取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测定其浓度，计算相对标准偏差。结果表明，绿原酸，对-香豆酸和金丝桃苷峰面积的RSD分别为2.4%、2.9%和2.3%，均小于3%，表明供试品溶液室温放置12 h比较稳定。

2.3.4 重复性实验 取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，测定其浓度，计算相对标准偏差。结果表明，绿原酸，金丝桃苷和对-香豆酸的RSD分别为2.2%、3.0%和3.0%，表明方法重复性好。

2.3.5 加样回收率实验 取已知含量的药材粉末6份，分别加入适量绿原酸、金丝桃苷和对-香豆酸对照品，供试品溶液制备方法制备，并依法测定，计算回收率。结果表明，绿原酸，对-香豆酸和金丝桃苷的平均回收率分别为100%、102%、102%，其RSD分别为3.2%、1.7%和3.1%，结果表明绿原酸，对-香豆酸和金丝桃苷的提取方法可行。

3 样品测定

分别吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，对照品和菟丝子样品的色谱图见图1，可知在该色谱条件下，被测化合物分离度良好，无杂质峰干扰，可用于不同产地样品分析。不同购买地的菟丝子样品中绿原酸、金丝桃苷和对-香豆酸含量测定结果见表1，从表中可知不同地区药店菟子丝质量存在较大差异，绿原酸含量在0.06%～0.43%之间，对-香豆酸在0.02%～0.56%之间，金丝桃苷在0.10%～1.07%之间。

图1 菟丝子样品HPLC色谱图及对照品的HPLC色谱图

4 结论

本文建立了一种简单、稳定、重复性好、可靠的HPLC同时测定菟丝子中3种化学成分绿原酸、金丝桃苷和对-香豆酸含量的方法，能够用于菟丝子质量评价，为其质量控制提供了新的研究方法。

表1 绿原酸、金丝桃苷和对-香豆酸含量%

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Determination of chlorogenic acid，p-coumarin and hyperin of Cuscuta chinensis Lam.by high performance liguid chromatography

TIAN Yu-fei,LIU Jiao,LI Jin,MA Lin,HE Jun,LIU Er-wei,CHANG Yan-xu
（Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

[Objective]To establish a sensitive method for simultaneous determination of chlorogenic acid,pcoumarin and hyperin in order to provide some evidences for the quality control of Cuscuta chinensis Lam..[Methods]Methanol and 0.05%formic acid were used as mobile phase.The sample was separated on an ODS C1825 column(4.6 mm×250 mm，5 μm)by gradient elution.The flow rate was 1.0 mL/min.The wavelength was set at 360 nm.[Results]Chlorogenic acid,p-coumarin and hyperin were well separated by HPLC.Linearity ranges were 2.00～100 μg/mL(r=0.999 3),6.25～100 μg/mL(r=0.999 1)and 0.50～5 0 μg/mL(r=0.999 1)for chlorogenic acid,pcoumarin and hyperin,respectively.[Conclusion]The simple and feasible HPLC method was established to evaluate the quality of Cuscuta chinensis Lam..

Cuscuta chinensis Lam.;HPLC;Chlorogenic acid;P-coumarin;Hyperin

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0372-03

2014-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.15

高等学校博士学科点专项科研基金（201012101 20007）；国家自然科学基金（81001632）；中国博士后基金（201 00480657）；教育部科学技术重点项目（210013）和天津市科技支撑计划重大项目（10ZCZDSY12400）。

田雨霏（1990-），女，2009级本科生，从事中药资源研究。

常艳旭，E-mail:tcmcyx@126.com。