丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的实验研究

王浩 耿赵铭 胡智伟 呙登俊

丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的实验研究

王浩 耿赵铭 胡智伟 呙登俊

目的 探讨丹皮酚对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制。方法采用不同浓度丹皮酚预处理SH-SY5Y细胞，加入鱼藤酮诱导建立帕金森病（PD）神经元损伤模型，以CCK-8检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡，组织活性氧荧光定量法（DCFH-DA法）检测细胞内活性氧（ROS）生成，并以JC-1染色检测线粒体膜电位（MMP），同时检测凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（caspase-3）活性。结果1μmol/L鱼藤酮处理24 h后SH-SY5Y细胞增殖活性显著降低，凋亡细胞数增多，ROS生成增加，MMP降低，caspase-3活性升高（均P＜0．01），说明PD神经元损伤模型建立成功。与鱼藤酮处理组比较，丹皮酚(5、25μmol/L)预处理后SH-SY5Y细胞增殖活性提高，凋亡细胞数减少，ROS生成受到抑制，MMP改善，而caspase-3活性降低（P＜0．05或0．01）。结论丹皮酚(5、25μmol/L)对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与丹皮酚的抗氧化作用等有关。

丹皮酚 鱼藤酮 帕金森病 凋亡

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人常见的一种中枢神经系统退行性疾病。随着人口老龄化，PD发病率达1.00%～3.00%，并呈上升趋势[1-2]。PD主要病理特征是黑质多巴胺能神经元进行性丢失，并伴有路易小体形成。临床表现为运动迟缓、静止性震颤及姿态和步态异常等，部分患者还伴有焦虑抑郁、痴呆及自主神经功能障碍等症状[2-5]。目前PD的确切发病机制尚不完全清楚，有研究表明氧化应激与线粒体功能障碍在PD患者的黑质多巴胺能神经元凋亡中起重要作用[2-4]。

丹皮酚（paeonol）是从毛茛科植物牡丹和萝藦科植物徐长卿全草中提取的中药单体，具有抗氧化、抗过敏、抗炎等作用[6]。目前的体内外研究均表明丹皮酚具有一定的神经保护作用，但其能否抑制PD患者的神经元凋亡尚无报道。SH-SY5Y细胞属于多巴胺能神经元，已被广泛应用于神经病理模型的建立。鱼藤酮（rotenone）是一种线粒体复合物Ⅰ（complexⅠ）活性抑制剂，能够诱导模拟PD的神经元损伤病理生理改变，目前常用于PD的实验研究[7]。本研究采用鱼藤酮诱导建立SHSY5Y细胞损伤模型，从细胞水平评价丹皮酚对多巴胺能神经元凋亡的影响并初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.l试剂和仪器 SH-SY5Y细胞株购自中科院上海细胞库；鱼藤酮、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）、4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、JC-1等购自美国Sigma公司；丹皮酚注射液（主要成分为丹皮酚，10mg/2ml·支）购自上海第一生化药业公司，实验时以无菌培养液配置；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；caspase-3试剂盒购自南京建成公司；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。FACSalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson产品，Elx800酶标仪为美国Bio-TEK公司产品。

1.2 细胞培养与分组 SH-SY5Y细胞常规复苏培养，待生长至80.00%融合时1∶4传代，选取对数生长期细胞进行实验。实验分为对照组、鱼藤酮处理组、鱼藤酮+丹皮酚预处理组(1、5和25μmol/L 3个浓度)共5组。细胞接种于96或24孔板中，接种密度为1×105/ml，24h后换液并加入不同浓度的丹皮酚，培养1h后分别加入终浓度为1μmol/ L鱼藤酮，对照组加入正常培养液，维持至实验结束。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖活性 各组细胞接种于96孔板，分别处理达预定作用时间后每孔加入10μl CCK-8反应液，37℃反应10min后，酶标仪测定450nm的吸光值（OD值），计算细胞增殖活性。细胞增殖活性（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞接种于100ml培养瓶中，待80.00%融合后分别予以不同处理，到达预定时间后消化、收集细胞，按照Annexin V-FITC试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 DCFH-DA法检测细胞内活性氧（ROS）生成 细胞分别予以不同处理，到达预定时间后消化、收集细胞，以无血清的培养液重悬并加入终浓度为10μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育30min，离心洗涤细胞后，荧光酶标仪检测荧光强度（激发波长488nm，发射波长525nm），ROS值（%）=（处理组荧光强度/对照组荧光强度）×100%。

1.6 JC-1检测细胞线粒体膜电位（MMP） 离心收集细胞后以PBS重悬，加入终浓度为10μg/ml的JC-1，置于37℃避光孵育30min，PBS洗涤2次后以荧光酶标仪检测MMP变化（激发波长488nm，发射波长525nm）。MMP（%）=（处理组荧光强度/对照组荧光强度）×100%。

1.7 细胞内caspase-3活性检测 收集细胞，以预冷的PBS洗涤后，细胞裂解液重悬，冰上孵育20min，14 000r/ min 4℃离心15min。取上清液用BCA法检测蛋白浓度，剩余上清液检测caspase-3活性，按试剂盒说明书操作：取5μl上清液加入caspase-3荧光底物（AC-DEVDAMC）中，避光孵育90min，荧光酶标仪检测分析（激发波长360nm，发射波长460nm），结果标准化为每mg蛋白的荧光强度。计算公式caspase-3活性（%）=（处理组每mg蛋白荧光强度/对照组每mg蛋白荧光强度）×100%。

1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

2 结果

2.1 丹皮酚减轻鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞增殖活性下降 在前期预实验中采用不同浓度鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤建立PD模型，CCK-8法检测结果显示鱼藤酮1μmol/L作用24h后细胞增殖活性以及LDH释放的变化较明显（本文中未显示相关结果），因此本研究选择1μmol/L鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞PD样损伤。不同浓度丹皮酚在鱼藤酮处理前1h加入，维持至实验结束。结果显示，与对照组比较，鱼藤酮处理组细胞增殖活性下降（P＜0.01）；与鱼藤酮处理组比较，丹皮酚（5、25μmol/L）处理后细胞增殖活性升高，具有统计学差异（P＜0.05或0.01），而且随着丹皮酚药物浓度增加，保护作用随之增强，见表1。

2.2 丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡 流式细胞术检测结果表明，1μmol/L鱼藤酮处理后SHSY5Y细胞凋亡明显增多（P＜0.01），而丹皮酚（5、25μmol/L）预处理则减少细胞凋亡，且随着丹皮酚药物浓度增加，细胞凋亡率降低（P＜0.05或0.01），见表1。

表1 丹皮酚对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞增殖活性与凋亡率变化的影响（%）

2.3 丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞ROS产生 与对照组比较，鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞内ROS的水平明显升高（P＜0.01）；而与鱼藤酮处理组比较，丹皮酚（5、25μmol/L）预处理可以明显抑制鱼藤酮诱导的ROS升高（P＜0.05或0.01），其中以25μmol/L组抑制效果更加明显，见表2。

2.4 丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞中MMP的下降 与对照组比较，鱼藤酮处理组SH-SY5Y细胞MMP显著下降（P＜0.01），提示线粒体能量耗竭；而与鱼藤酮处理组比较，丹皮酚（5、25μmol/L）预处理可以明显改善鱼藤酮诱导MMP下降（P＜0.05或0.01），其中以25μmol/L组抑制效果更加明显，见表2。

表2 丹皮酚对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞ROS生成与MMP变化的影响（%）

2.5 丹皮酚抑制鱼藤酮诱导的细胞caspase-3活化 与对照组SH-SY5Y细胞比较，鱼藤酮处理组caspase-3活性上调，具有统计学差异[（100.00±5.64）%vs（131.88± 7.65）%，P＜0.01]。而1μmol/L丹皮酚预处理后细胞caspase-3活性为（122.20±7.51）%，与对照组比较有统计学差异（P＜0.01）；而5μmol/L丹皮酚预处理后活性为（112.76±8.85）%，25μmol/L丹皮酚预处理后为（105.29±6.28）%，与鱼藤酮处理组比较，（5、25μmol/L）丹皮酚预处理后细胞caspase-3活性受到抑制（P＜0.05或0.01），且以25μmol/L组效果更加明显。

3 讨论

PD是由多种因素共同所致的一种中枢神经系统退行性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元进行性丢失为主要病理特征，并伴有残存神经元内路易小体形成[2-3]。PD的发生机制与遗传因素、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症以及细胞凋亡等密切相关，目前认为细胞凋亡是PD发生的中心环节，因此如何减少神经元凋亡已成为防治PD的研究热点之一[2-4]。

丹皮酚是从毛茛科植物牡丹和萝藦科植物徐长卿的全草中提取出来的中药单体，具有抗氧化、抗炎、抗菌等药理作用[6]。研究发现丹皮酚对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用，能够减轻血脑屏障通透性，抑制ROS生成[8-9]；同时丹皮酚还能减轻β-淀粉样蛋白诱导的海马神经元损伤[10]；并可以有效地改善脑缺血、糖尿病及阿尔茨海默病小鼠认知障碍[9-12]。此外，丹皮酚还能调节小胶质细胞介导的炎症[13]。目前，体内外研究均表明丹皮酚具有一定的神经保护作用，但其对于神经元凋亡是否存在保护作用尚未见于报道。

因此，本研究中采用鱼藤酮建立PD神经元损伤模型，探讨了丹皮酚对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。研究结果提示丹皮酚对鱼藤酮诱导的SHSY5Y细胞凋亡有一定程度的保护作用，并呈浓度效应关系，以丹皮酚（5、25μmol/L）作用明显。

在PD发病机制中，氧化应激与线粒体功能障碍在神经元凋亡中发挥了重要作用，氧化应激产生的ROS可引起线粒体复合物Ⅰ（complexⅠ）功能障碍，而后者又会促进ROS进一步生成，两者互相作用导致恶性循环[14]。线粒体是细胞凋亡的主要开关，线粒体功能下降，不仅促使ROS生成增多，同时也会引起ATP合成减少，线粒体膜去极化，造成MMP下降及渗透性通道的开放，进一步将会引起细胞色素C释放，继而活化依赖于caspase的凋亡信号通路，最终导致细胞凋亡，影响组织器官功能[3,14-15]。本研究中以DCFH-DA法检测细胞内ROS生成，以JC-1检测MMP来反映线粒体膜通透性的改变。结果显示1μmol/L鱼藤酮作用24 h，SH-SY5Y细胞内ROS生成增多，MMP下降。而丹皮酚（5、25μmol/ L）预处理后可部分抑制鱼藤酮诱导的ROS生成，并使MMP回升，笔者推测该效应的部分机制与丹皮酚的抗氧化活性有关。

caspase-3是内、外源性凋亡通路共有的终末效应酶，在细胞凋亡的过程中发挥重要作用。正常状态下以无活性的酶原形式存在于细胞质中，在多种凋亡刺激信号作用下被活化，裂解相应底物，最终导致凋亡发生[3,16]。因此，检测细胞内caspase-3活性也是凋亡检测的重要手段之一。本研究结果表明鱼藤酮处理后，SHSY5Y细胞caspase-3活性显著上调，而丹皮酚预处理（5、25μmol/L）使caspase-3活性下降。

综上所述，本研究结果提示，鱼藤酮通过促使ROS生成增多、MMP下降以及caspase-3活化等机制诱导神经元凋亡，而丹皮酚预处理可抑制以上效应，该保护作用可能与丹皮酚抗氧化活性有关，而丹皮酚的具体神经保护机制尚有待于进一步深入研究。

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Paeonol prevents SH-SY5Y cells from rotenone-induced apoptosis

Objective To investigate the effects of paeonol on rotenone-induced apoptosis in SH-SY5Y cells．MethodsSH-SY5Y cells were pretreated with paeonol and then rotenone was added in the culture medium．Cell viability was detected by CCK-8 assay．The apoptosis rate was assessed by flow cytometry．Cellular ROS production were detected by DCFH-DA．The mitochondial membrane potential(MMP)was determined by JC-1 staining and the caspase-3 activity was measured by caspase-3 kit．Results1μmol/L rotenone significantly decreased cell viability,enhanced the apoptotic rate and overproduced ROS,reduced MMP and increased caspase-3 activity．Compared to rotenone treated group,5,25μmol/L paeonol significantly ameliorated cell damage,inhibited apoptotic rate and ROS overproduction,alleviated the decrease of MMP and reduced the caspase-3 activity．ConclusionPaeonol can prevent SH-SY5Y cells from apoptosis induced by rotenone,which may be associated with its anti-oxidant ability．

PaeonolRotenone Parkinson disease Apoptosis

2014-05-28）

（本文编辑：胥昀）

浙江省自然科学基金项目（Y2110679）

310012 杭州，浙江省立同德医院神经内科（王浩、胡智伟、呙登俊）；潍坊医学院临床医学系（耿赵铭）