PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织中的表达及与患者预后的相关性分析

张甘露 赵长林

PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织中的表达及与患者预后的相关性分析

张甘露 赵长林

目的 探讨直肠癌组织PI3K和Akt蛋白表达及其与患者预后的相关性。方法应用免疫组化技术检测PI3K和Akt蛋白在60例直肠癌组织、30例直肠腺瘤组织及10例正常直肠黏膜组织中的表达，并对60例直肠癌患者进行随访。结果PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织中均呈高表达，两者表达呈正相关（P＜0．05）。PI3K蛋白表达水平与患者术前CEA水平、分化程度、临床分期、淋巴结转移和远处转移相关（均P＜0．05或0．01）；与年龄、性别、肿瘤部位及形态无关（均P＞0．05）。Akt蛋白表达与患者术前CEA水平、临床分期、淋巴结转移和远处转移相关（均P＜0．01）；与年龄、性别、肿瘤部位和形态、分化程度无关（均P＞0．05）。Cox回归模型分析显示远处转移是直肠癌预后的独立危险因素（P＜0．05）。结论PI3K和Akt蛋白的高表达与直肠癌发生、发展密切相关并起协同作用。

直肠肿瘤 PI3K Akt预后

近年来，随着人们生活水平的提高以及生活习惯的改变，直肠癌的发病率逐年增加。直肠癌的发生、发展是多基因、多步骤以及多因素协调累积的结果，涉及多个癌基因和抑癌基因及其调控信号通路的异常改变。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt/ PKB）信号通路在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用。本研究应用免疫组化技术观察PI3K和Akt蛋白在结直肠癌组织中的表达，探讨其在直肠癌发生、发展及转移中的作用以及对患者预后的影响。

1 材料和方法

1.1 标本来源 收集大连大学附属新华医院2006-01—2009-12手术切除的直肠癌组织蜡块标本60例，均经病理学检查证实，所有患者术前均未进行放、化疗及生物免疫治疗，另收集直肠腺瘤组织蜡块30例、正常直肠黏膜组织蜡块10例，所有标本病例资料齐全。直肠癌标本中，男37例，女23例；年龄30～75岁，中位年龄53岁，其中≤60岁31例，＞60岁29例。肿瘤部位：上段（距肛缘＞7cm）9例，中下段（距肛缘＜7cm）51例；肿瘤形态：隆起型19例，溃疡型41例；术前CEA：正常28例，升高32例；分化程度：高分化21例，中/低分化39例。临床分期：Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期38例；术前淋巴结转移：无23例，有37例；术前远处转移：无44例，有16例。临床病理分期按美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（ICC）结肠癌TNM分期标准（2010年，第7版），病理诊断均由病理科资深医师经双盲法核实确定。

1.2 实验试剂和设备 即用型兔抗人PI3K单克隆抗体及兔抗人Akt单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，工作浓度为1∶100。即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒、柠檬酸盐抗原修复液（pH=6.0）与PBS磷酸盐缓冲粉剂（pH= 7.4）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 实验方法及步骤 本实验采用免疫组化快捷型SP法。具体步骤：切片脱蜡水化，高压抗原修复，3.00%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，滴加一抗（PI3K/Akt）室温孵育60min，PBS冲洗，滴加即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂，室温孵育10min，PBS冲洗，滴加DAB溶液显色，自来水充分冲洗，复染并封片。采用抗体公司提供的已知阳性乳腺癌切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断 PI3K和Akt蛋白均为胞质表达，为棕黄色颗粒。阳性细胞必须具备：细胞结构清晰，阳性染色定位准确，着色明显高于背景。随机选择10个不同高倍镜视野（×400），每个视野计数100个细胞，取其均值，按其中阳性细胞所占比例计分：阴性（-）：无棕黄色反应，随机视野中无阳性细胞；弱阳性（+）：均匀分布浅棕黄色反应，阳性细胞比例＜25.00%；中等阳性（++）：深棕黄色反应，阳性细胞比例25.00%～50.00%；强阳性（+++）：棕黑色反应，阳性细胞比例＞50.00%。

1.5 随访 随访起始时间为手术时间，截止时间为2011-09-30，随访终点为患者死亡日期，随访方式采用门诊复查及住院病历、电话随访相结合的方式；中位随访时间为44.5个月（0.5～106个月），失访5例，失访率8.33%。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件。计数资料的组间比较采用χ2检验、χ2检验的校正公式及Fisher精确检验；相关性检验采用Spearman等级相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，以Long-rank检验进行单因素分析，以Cox回归模型进行多因素分析，得到患者预后的独立危险因素。

2 结果

2.1 PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织、直肠腺瘤组织及正常直肠黏膜组织中的表达 PI3K蛋白在直肠癌组织、直肠腺瘤组织、正常直肠黏膜组织中阳性表达率分别为75.00%（45/60）、33.30%（10/30）、30.00%（3/ 10），直肠癌组织PI3K阳性表达率明显高于直肠腺瘤组织和正常直肠黏膜组织（均P＜0.01）。Akt蛋白在直肠癌组织、直肠腺瘤组织、正常直肠黏膜组织中阳性表达率分别为60.00%（36/60）、33.30%（10/ 30）、10.00%（1/10），直肠癌组织Akt阳性表达率明显高于直肠腺瘤组织和正常直肠黏膜组织（均P＜0.01），见图1。

图1 PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织、直肠腺瘤组织及正常直肠黏膜组织中的表达（A：PI3K在直肠癌组织中的表达；B：PI3K在直肠腺瘤组织中的表达；C：PI3K在正常直肠黏膜组织中的表达；D：Akt在直肠癌组织中的表达；E：Akt在直肠腺瘤组织中的表达；F：Akt在正常直肠黏膜组织中的表达；免疫组化SP法，×100）

2.2 PI3K和Akt蛋白表达的相关性 60例直肠癌标本中，PI3K和Akt蛋白同时表达阳性者占51.67%（31/ 60），同时表达阴性者16.70%（10/60），PI3K蛋白阳性而Akt蛋白阴性者23.30%（14/60），PI3K蛋白阴性而Akt蛋白阳性者8.30%（5/60）。Spearman相关分析提示，PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织中的表达呈正相关（r= 0.314，P＜0.05）。

2.3 PI3K和Akt蛋白表达与直肠癌患者临床病理特征的关系 本实验结果显示，直肠癌组织中PI3K蛋白表达水平与术前CEA水平、分化程度、临床分期、淋巴结转移和远处转移相关（均P＜0.05或0.01）；与年龄、性别、肿瘤部位及形态无关（均P＞0.05）。Akt蛋白表达水平与术前CEA水平、临床分期、淋巴结转移和远处转移相关（均P＜0.01）；与患者的年龄、性别、肿瘤部位和形态、分化程度无显著相关性（均P＞0.05），见表1。

2.4 直肠癌患者PI3K和Akt蛋白表达的单因素生存分析 经Kaplan-Meier生存分析，PI3K和Akt蛋白表达、肿瘤形态、分化程度、淋巴结转移及远处转移与直肠癌患者生存期相关（均P＜0.05或0.01），而年龄、性别、肿瘤部位、术前CEA及临床分期与直肠癌患者生存期无显著相关性（均P＞0.05），见表2及图2-4。

2.5 多因素生存分析 Cox回归模型分析发现只有远处转移是直肠癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），而PI3K和Akt蛋白表达不影响直肠癌患者的生存期（均P＞0.05），见表3。

表1 直肠癌组织PI3K和Akt蛋白表达与患者临床病理特征的关系（例）

3 讨论

PI3K-Akt信号通路与细胞的增殖、分化及代谢方面密切相关，该通路的异常活化在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。PI3K是细胞内信号传导有关的脂类第二信使，由调节亚基p85和催化亚基p110构成[1]。PI3K可分为3类，其结构与功能各异，其中研究最广泛的为Ⅰ类PI3K，此类PI3K为异源二聚体，由一个调节亚基p85和一个催化亚基p110组成[2]。调节亚基含SH2、 SH3结构域，与含有相应结合位点的靶蛋白相作用。多种生长因子和信号传导复合物，包括成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管生成素（Ang1）和胰岛素都能启动PI3K的激活过程。当PI3K的p85调节亚基被募集到临近细胞膜的部位，p110亚基通过与p85亚基结合将底物磷脂酰肌醇2磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇3磷酸（PIP3）。PIP3可以和蛋白激酶B（PKB）的N端PH结构域结合，使Akt从细胞质转移到细胞膜上，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）的辅助下，通过使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点（Thr 308）和丝氨酸磷酸化位点（Ser 473）磷酸化而使其激活。Liu等[3]的研究显示PI3K在胃癌原发灶、转移灶以及转移淋巴结中均高表达。Johnson等[4]的研究显示PI3K和Akt蛋白在直肠癌组织中高表达，本研究也提示，直肠癌组织PI3K阳性表达率明显高于正常直肠黏膜组织和直肠腺瘤组织。这表明PI3K的表达与直肠癌的发生、发展相关，其机制可能是通过促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡来实现的。

表2 PI3K和Akt蛋白表达相关性分析

图2 PI3K不同表达的直肠癌患者的生存曲线

图3 Akt不同表达的直肠癌患者的生存曲线

图4 有远处转移和无远处转移直肠癌患者的生存曲线

表3 Cox多因素生存分析

Akt是一个在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K下游主要的效应物。Akt可分为3种亚型（Akt1、Akt2、Akt3或PKBα、PKBβ、PKBγ）。活化的Akt通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能。持续激活的Akt主要作用于抗凋亡通路，拮抗由人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）介导的细胞凋亡。PTEN是一种肿瘤抑制基因，位于人染色体10q23，具有磷酸酶的双重活性，负性调节PI3K-Akt信号通路的活性[5]。

伏代刚等[6]研究显示溃疡性结肠炎及直肠癌患者中Akt蛋白表达均高于正常组织，随着溃疡性结肠炎病程的进展，Akt蛋白表达逐渐增强，由此认为在溃疡性结肠炎-肿瘤的疾病演进过程中，Akt蛋白表达的增强可能与溃疡性结肠炎发生及癌变相关，Akt蛋白可能成为直肠癌早期的生物标志物。殷舞等[7]的研究发现PI3K和Akt蛋白在大肠癌腺瘤性转化中表达异常，与腺瘤的癌变进展有关，其表达强度随肿瘤的恶性转化而增加，在腺癌中表达最强，这提示了Akt在直肠癌的发生中起重要作用。本研究结果显示直肠癌组织中PI3K和Akt蛋白阳性表达率与直肠腺瘤组织和正常直肠黏膜组织相比较均有统计学差异，并且直肠癌组织中PI3K与Akt蛋白表达呈正相关，这与Baba等[8]的相关研究结果一致，提示PI3K-Akt信号通路在直肠癌组织中过度激活，可能在直肠癌的发生、发展中起到了重要作用。在患者的临床病理特征方面，此通路过度活化与直肠癌患者术前CEA水平、临床分期、淋巴结转移及远处转移有关，其中PI3K蛋白过表达还与分化程度有关，而与其他病理因素无明显相关性，提示PI3K-Akt信号通路的过度表达与肿瘤的恶性程度有关并可能影响到患者的预后。

关于直肠癌预后影响因素的分析也是近年来研究的热点。有报道显示淋巴结转移是影响大肠癌患者预后的最重要因素。易呈浩等[9]研究显示肿瘤浸润深度、转移淋巴结数、送检标本淋巴结总数、邻近器官受累、远处转移等是影响结直肠癌预后的独立危险因素。汪建平等[10]的研究显示肿瘤的大体分型、分化程度是影响结、直肠癌患者术后生存的独立因素。Baba等[8]的研究显示Akt是影响直肠癌的独立危险因素。Cai等[11]的荟萃分析显示Akt蛋白表达与卵巢癌的总生存期及无病进展时间有关，但现有的证据不足以支持PI3K-Akt作为临床实践中判断患者预后的影响因子。在本研究中，PI3K蛋白及Akt蛋白表达、肿瘤形态、分化程度、淋巴结转移及远处转移与直肠癌患者生存期相关，而年龄、性别、肿瘤部位、术前CEA及临床分期与直肠癌患者生存无显著相关性，进一步采用Cox回归模型多因素分析发现只有远处转移是影响患者预后的独立危险因素。PI3K和Akt蛋白表达与预后的相关性目前仍存在争议，需要更多的临床资料及数据进一步研究。

PI3K-Akt信号通路对于细胞增殖、分化和凋亡的调节是必要的，其活化与肿瘤发生及侵袭转移的相关性提示以该信号通路为靶点的研究将有可能提高恶性肿瘤临床治疗的效果。随着对PI3K-Akt信号通路分子机制研究以及对该信号通路在肿瘤侵袭转移中的作用机制的深入研究，在不久的将来，以PI3K-Akt通路为靶点的药物将在肿瘤的临床治疗中发挥越来越重要的作用。

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Expression of PI3K and Akt proteins in rectal cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of PI3K and Akt proteins in rectal cancer and its clinicopathological significance．MethodsPI3K and Akt proteins were stained immunohistochemically in 60 samples of rectal cancer,30 samples of rectal adenoma and 10 samples of normal rectal mucosa．ResultsBoth PI3K and Akt were highly expressed in rectal carcinoma tissue,and correlated with each other(P＜0．05)．The expression of PI3K was correlated with preoperative CEA level,tumor differentiation,clinical stage,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．05 or 0．01),but not correlated with gender,age,tumor morphology and location(P＞0．05)．The expression of Akt was correlated with preoperative CEA level,clinical stage,lymph node metastasis and distant metastasis(P＜0．01),but not correlated with gender,age,tumor morphology,location and differentiation(P＞0．05)．Multivariate analysis identified that distant metastasis was the independent prognostic factor for rectal cancer(P＜0．05)．ConclusionPI3K and Akt proteins are highly expressed in rectal cancer and correlated with clinicopathological features of patients．

Rectal neoplasma PI3K AktPrognosis

2014-03-05）

（本文编辑：胥昀）

310013 杭州，浙江医院肿瘤科（张甘露）；大连大学附属新华医院肿瘤科（赵长林）

赵长林，E-mail:zhongliuke2@163.com