脑出血后颅内HO-1的表达与脑损伤的关系研究

朱丹化 苏志鹏 陈贤斌 张宇 叶盛 诸葛启钏

脑出血后颅内HO-1的表达与脑损伤的关系研究

朱丹化 苏志鹏 陈贤斌 张宇 叶盛 诸葛启钏

目的 观察脑出血患者不同时间段血肿周围脑组织血红素加氧酶-1（HO-1）的表达趋势及其与脑损伤程度之间的关系。方法收集高血压脑出血手术患者皮层脑组织及血肿周围脑组织标本共60例，以免疫组化方法分别测定HO-1及8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达，分析发病不同时间段HO-1表达与患者脑损伤程度之间的关系。结果发病＜24h及1～3d的患者血肿周围脑组织HO-1阳性表达率分别为90．9%和85．7%，8-OHdG的阳性表达率分别为86．4%和90．5%，与发病＞3d患者比较均有统计学差异（均P＜0．05），而发病＜24h患者HO-1和8-OHdG阳性表达率与发病1～3d患者比较均无统计学差异（均P＞0．05）。结论脑出血后3d内血肿周围脑组织HO-1表达最强，3d后较前减弱，与脑损伤的程度及治疗时间窗一致。脑出血后3d内是手术及药物干预的最佳时期。

脑出血 血红素加氧酶-1 8－羟基－2－脱氧鸟苷 免疫组化

脑出血是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，在我国占全部脑卒中的20.0%～30.0%，急性期病死率为30.0%～40.0%。为了降低脑出血的致死率和致残率，改善患者预后，近年来对于脑出血介导的脑损伤机制进行了很多研究。脑出血后的脑损伤机制非常复杂，对于可能的影响因素如血红蛋白代谢的起始酶和限速酶如血红素加氧酶-1（HO-1）等的研究在国内外已有报道[1]，但上述研究均为动物实验结果，相关的临床研究国内外一直未见报道。8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）是目前公认的DNA氧化损伤的标志物[2]，本研究以其作为判断脑损伤程度的标志。同时本研究通过观察脑出血患者不同时间段血肿周围脑组织HO-1表达趋势及其与脑损伤程度间的关系，旨在寻找手术与药物干预的最佳时机，改善患者预后。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2010-10—2013-11我科高血压脑出血手术患者皮层及血肿周围脑组织标本共60例，其中男38例，女22例，年龄40～77岁，平均59.25岁。发病时间＜24h组患者22例、1～3d组21例；3～7d组11例；＞7d组6例。手术方式为骨瓣开颅血肿清除术及直切口小骨窗开颅血肿清除术。纳入标准：选取符合全国第4届脑血管病学术会议修订诊断标准，并经头颅CT检查证实有手术指征的高血压脑出血患者，出血部位均位于基底核区。排除标准：（1）患有心肌梗死、严重肝肾功能不全、糖尿病、严重周围血管栓塞性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等其中任一疾病者；（2）发病前2周或入院时发生感染者；（3）服用吲哚美辛等炎症抑制药物、免疫抑制剂、糖皮质激素类药物等其中任一药物者；（4）血管畸形、烟雾病等其他血管性疾病患者。

1.2 方法 手术时取患者皮层脑组织及血肿周围脑组织各1块，其中皮层脑组织作为对照组，所有标本由同一位医师获取。浸泡4.0%多聚甲醛溶液24h，常规脱水，透明，石蜡包埋，切片厚度为4μm，常规HE染色。

1.2.1 实验试剂 兔抗人HO-1抗体购于Epitomics公司，Elivision免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购于DAKO公司。

1.2.2 实验方法 采用免疫组化Elivision两步法测定脑组织中HO-1及8-OHdG的表达，HO-1一抗稀释比例为1∶150，二抗采用DAKO试剂盒，DAB显色，以TBS代替一抗作为阴性对照，以正常脑组织标本为阳性对照。测定8-OHdG时，以0.01M PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性片作为阳性对照。

1.2.3 结果分析及判定 所有染色标本均由2位病理科医师双盲下进行评价。免疫组化阳性细胞数由每个切片随机取5个高倍视野获得，显色强度数据由美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus图像分析管理系统软件自动生成。评分标准：以切片中阳性细胞数分级和显色强度分级作为标准。显色强度分级计分：无着色为0分，淡黄染色为1分，棕黄色/棕褐色颗粒为3分；阳性细胞数分级计分：0～1.0%为0分，1.0%～10.0%为1分，10.0%～50.0%为2分，50.0%～80.0%为3分，80.0%～ 100.0%为4分。最终评分=显色强度分级计分×阳性细胞数分级计分。最终评分3～5分为（+），6～9分为（++），10～12分为（+++），凡（+）或（+）以上者均为阳性表达。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 HE染色 可见血肿周围脑组织有不同程度的脑水肿和神经元受损现象，表现为神经元和小血管周围空隙，细胞核固缩、染色质边集和核碎裂、溶解，见图1。

2.2 患者脑组织的HO-1表达 HO-1在对照组皮层脑组织的阳性表达率为20.0%（4/20），而血肿周围脑组织阳性表达率在＜24h组患者为90.9%（20/22）、1～3d组为85.7%（18/21）、3～7d组为45.5%（5/11）及＞7d组为50.0%（3/6），各组与对照组间比较均有统计学差异（均P＜0.05）；＜24h组与1～3d组间比较无统计学差异（P＞0.05）；但与3～7d组及＞7d组比较均有统计学差异（均P＜0.05），见图2及表1。

2.3 患者脑组织的8-OHdG表达 8-OHdG在对照组皮层脑组织的阳性表达率为40.0%（8/20），而血肿周围脑组织阳性表达率在＜24h组患者为86.4%（19/22）、1～3d组为90.5%（19/21）、3～7d组为54.5%（6/11）及＞7d组为66.7%（4/6），各组与对照组间比较均有统计学差异（均P＜0.05）；＜24h组与1～3d组间比较无统计学差异（P＞0.05）；但与3～7d组及＞7d组比较均有统计学差异（均P＜0.05），见图3及表1。

图1 患者脑组织标本病理切片（A：对照组皮层脑组织；B～E：血肿周围脑组织有不同程度的脑水肿和神经元受损现象，表现为神经元和小血管周围空隙，细胞核固缩、染色质边集和核碎裂、溶解；HE染色，×400）

图2 患者脑组织中HO-1的表达（A：对照组皮层脑组织HO-1表达阴性；B～C：＜24h组和1～3d组血肿周围脑组织HO-1较多阳性表达；D～E：3～7d组和＞7d组血肿周围脑组织HO-1少量阳性表达；免疫组化Elivision两步法，×400）

3 讨论

脑出血又称脑溢血，是指非外伤性脑实质内的自发性出血，其病因多样，绝大多数是由于高血压小动脉硬化的血管破裂引起，故也称高血压性脑出血。脑出血是中老年人常见的急性脑血管病，病死率和致残率很高，是脑血管疾病中病死率最高的临床类型。

研究发现，脑出血后血凝块中红细胞的分解产物和分解过程与脑组织损伤有密切关系。红细胞溶解释放出血红蛋白并降解为血红素，血红素经过HO-1分解后产生胆绿素、一氧化碳和铁[3]。HO-1是催化血红素分解的起始酶和限速酶，是一种应激蛋白，在人体发热、脑出血及缺血、缺氧等应激情况下，可被诱导产生，其表达也是引起脑出血后脑损伤的重要原因之一[4]。

关于脑出血后HO-1的表达变化趋势及与脑损伤的关系，许多学者进行了大量研究。孟庆伟等[5]制作大鼠脑出血模型，发现血肿周围脑组织中HO-1的表达在24h显著增多，48～72 h达到高峰，之后逐渐下降。而Gong等[6]研究发现在脑出血模型大鼠腹腔内注射HO-1抑制剂原卟啉（SnPP），可使脑出血后脑水肿明显减轻。杨奎等[7]采用自体血注射制作大鼠脑出血模型，以药物栀子总环烯醚萜苷进行干预，发现可以抑制脑出血后HO-1表达并减轻脑水肿。这些都间接证明脑出血后HO-1的表达与脑水肿有密切关系。但上述实验均在动物模型阶段，尚未取得人体内环境下的直接证据。本实验以不同发病时间有手术指征的脑出血患者的脑组织作为研究对象，通过免疫组化测定并评估脑组织HO-1和8-OHdG阳性表达率，发现发病＜24h组和1～3d组的患者血肿周围脑组织HO-1和8-OHdG的阳性表达率明显高于发病＞3d的两组，并具有统计学差异；而发病＜24h组和1～3d组患者的组间比较无统计学差异，表明脑出血后3d内血肿周围脑组织HO-1表达升到最高峰，并与脑损伤的程度同步。本研究结论系在人体内环境下获取标本得出的，并与动物模型实验结果相符，可为以后临床干预提供偱证医学证据。

综上所述，本实验发现脑出血后3d内HO-1表达最强，同时脑损伤的程度最强，3d后较前减弱，表明脑出血后3d内是HO-1抑制剂用药及手术干预的最佳时机，积极干预可以减轻脑出血后脑损伤程度，从而改善患者的神经功能预后。

图3 患者脑组织中8-OHdG的表达（A：对照组皮层脑组织8-OHdG表达阴性；B～C：＜24h组和1～3d组血肿周围脑组织8-OHdG较多阳性表达；D～E：3～7d组和＞7d组血肿周围脑组织8-OHdG少量阳性表达；免疫组化Elivision两步法，×400）

表1 不同时间段各组脑组织HO-1和8-OHdG表达的结果（例）

[1]Wang J,Doré S．Inflammation after intracerebral hemorrhage [J]．J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):894-908．

[2]高玉楠,杨靖,宋沁馨,等．8-羟基脱氧鸟苷作为DNA氧化损伤标志物在疾病诊断中的应用[J]．药物与医学,2012,17(6):223-227．

[3]Ewing J F,Maines M D．Regulation and expression of heme oxygenase enzymes in aged-rat brain:age related depression in HO-1 and HO-2 expression and altered stress-response[J]．J Neural Transm,2006,113(4):439-454．

[4]Soares M P,Bach F H．Heme oxygenase-1:from biology to therapeutic potential[J]．Trends Mol Med,2009,15(2):50-58．

[5]孟庆伟,郭景红,吴家幂．红细胞致脑出血后血肿周围脑组织HO-1的表达[J]．中风与神经疾病杂志,2004,12(4):360-361．

[6]Gong Y,Tian H,Xi G,et al．Systemic zinc protoporphyrin administration reduces intracerebral hemorrhage-induced brain injury[J]．Acta Neurochir Suppl,2006,96(2):232-236．

[7]杨奎,石娅萍,向靓,等．栀子总环烯醚萜苷对脑出血大鼠血红素氧合酶-1表达的影响[J]．中药新药与临床药理,2008,19(1):9-11．

Relationship between intracranial HO-1 expression and brain injury after cerebral hemorrhage

Objective To investigate the expression of heme Oxygenase-1(HO-1)in brain tissue its relation to brain injury after cerebral hemorrhage．MethodsCerebral tissue samples round hematoma were collected during surgery from 60 patients with hypertensive cerebral hemorrhage admitted during October 2010 to November 2013．The expression of HO-1 and 8-hydroxy-2-deoxyguanosine(8-OHdG)in brain tissue was determined immunohistochemically,and the relationship between HO-1 and 8-OHdG was analyzed．ResultsThe expression rate of HO-1 in patients with onset＜24 h and 1～3 d was 90．9% and 85．7%respectively（P＞0．05）;expression rate of 8-OHdG in patients with onset＜24 h and 1～3 d was 86．4%and 90．5% respectively（P＞0．05）．There were significant differences in expression of HO-1 and 8-OHdG between patients with onset＜24 h,1～3d and those with onset＞3d (P＜0．05)．ConclusionHO-1 is highly expressed in brain tissue around hematoma within 3 days after cerebral hemorrhage,indicating the optimal time for surgery and drug intervention．

Cerebral hemorrhage Heme oxygenase-1 8-hydroxy-2-deoxyguanosine Immunohistochemical

2014-05-26）

（本文编辑：胥昀）

温州市科技计划项目（Y20100359）

325000 温州医科大学附属第一医院神经外科

苏志鹏，E-mail:zhipengsu@gmail.com