丙酮酸乙酯对滑膜细胞HMGB1的影响及机制

金小福 蒋琼 罗心静

丙酮酸乙酯对滑膜细胞HMGB1的影响及机制

金小福 蒋琼 罗心静

目的 探讨丙酮酸乙酯对类风湿关节炎（RA）滑膜细胞高迁移率族蛋白-1（HMGB1）表达的影响及分子机制。 方法将培养的RA滑膜细胞分为正常对照组、TNF-α组和丙酮酸乙酯+TNF-α组；采用RT-PCR法检测细胞HMGB1 mRNA表达；ELISA法检测细胞培养上清液中HMGB1、IL-6和IL-8含量；采用Western blot法分别检测滑膜细胞胞质和核内NF-κB变化；采用免疫荧光法观察NF-κB在细胞中的分布。 结果 丙酮酸乙酯可抑制TNF-α诱导滑膜细胞IL-6、IL-8、HMGB1的分泌和HMGB1 mRNA的表达，以及NF-κB（p65）在滑膜细胞核内的表达和移位。 结论 丙酮酸乙酯能下调滑膜细胞HMGB1表达和抑制NF-κB信号通路活化，可能对RA发挥抗炎作用。

类风湿关节炎 高迁移率族蛋白-1 滑膜细胞 核因子-κB 丙酮酸乙酯

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以滑膜炎症和关节结构破坏为特征的慢性炎症性疾病，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要疾病之一[1]。细胞因子和炎症介质在RA的滑膜炎症及骨质破坏中起到重要作用。其中，高迁移率族蛋白-1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）作为晚期炎症介质，是RA病变持续存在、迁延进展的重要因素，是防治RA发生的潜在靶点[2]，而核因子（NF）-κB信号通路活化是RA时炎症因子大量生成的分子基础。丙酮酸乙酯能够影响多种早期炎症介质的表达，在RA等关节炎症性疾病中发挥抗炎作用。然而，丙酮酸乙酯是否影响RA晚期炎症介质HMGB1的表达和释放及其机制，目前尚无报道。本研究采用TNF-α刺激人类滑膜细胞，观察丙酮酸乙酯对HMGB1的表达和释放及对NF-κB信号通路活化的影响，以探讨丙酮酸乙酯在治疗RA炎症中的作用及机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 RA滑膜成纤维细胞（美国cell application公司）；TNF-α（美国RD公司）；TRIZOL试剂、cDNA第一链合成试剂盒；PCR mix（美国Life Technologies）；PCNA小鼠单克隆抗体、HMGB1兔多克隆抗体（美国BD Biosciences公司），Actin兔单克隆抗体、NF-κB（p65）兔多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；HMGB1 ELISA Kit（捷克biovendor公司）；Hoechst 33258（美国Sigma公司）；PVDF膜(美国Millipore公司)；辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG；Cy3标记的羊抗兔IgG（美国Sigma公司）；DAB显色试剂盒（中国博士德生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 将对数生长期的人滑膜细胞5×104个用0.25%胰酶消化后，按1×104个接种于25cm2培养瓶，加入含10%FBS的DMEM培养液，在37℃、5%CO2的孵箱内培养24h。将细胞随机分为3组，正常对照组：不做任何处理；TNF-α组：加10ng/ml TNF-α刺激；丙酮酸乙酯+TNF-α（EP+TNF-α）组：加5mmol/L丙酮酸乙酯与10ng/ml TNF-α共同孵育。

1.2.2 RT-PCR检测细胞HMGB1 mRNA的表达 滑膜细胞处理6h后，采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，紫外分光光度计测量A260nm/A280nm比值。用鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶合成第一链；用1μg的反转录产物作为模板，引物如下：HMGB1：上游引物∶5′-CCG AATTCG CTT CTG TCA ACT TCT CAG AGT TTT CC-3′，下游引物：5′-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GAG GAT CCCGAA GGA GGC CTC TTG GGT GCA TTG-3′。GAPDH：上游引物：5′-AAGCCCATCACCATCTTCCA-3′。下游引物：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。GAPDH的PCR扩增反应条∶95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；GAPDH的PCR扩增反应条件：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增25个循环。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。利用凝胶成像分析系统进行紫外光成像和图形分析，测出各条带的光密度值，结果以HMGB1条带的光密度值/GAPDH条带的光密度值表示。

1.2.3 Western blot检测细胞NF-κB蛋白的表达 收集相应处理30min后的滑膜细胞，提取总蛋白及胞质蛋白、核蛋白。BCA法检测蛋白浓度。将样品蛋白与5× SDS加样缓冲液混合，100℃煮沸10min。样品经10% SDS-PAGE电泳分离后,电转移法转移到PVDF膜上。室温下封闭2h后，加入NF-κB（p65）兔多克隆一抗，4℃过夜。洗去一抗后，加入辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG二抗，反应2h。随后用DAB显色，光密度扫描定量分析。

1.2.4 ELISA检测细胞因子含量 收集相应处理24h后的滑膜细胞培养上清液，采用ELISA法检测细胞培养上清液中HMGB1、IL-6和IL-8含量。具体操作按相应试剂盒说明书进行。

1.2.5 细胞免疫化学观察NF-κB（p65）蛋白转位分布 将细胞用0.25%胰蛋白酶消化，按1.0×105个细胞分别接种于铺有灭菌干净盖玻片的6孔板中。细胞分别用TNF-α处理30min时间后，取出玻片，PBS清洗，多聚甲醛固定，0.3%Triton X-100通透30min，加入2%BSA封闭60min，加入NF-κB（p65）兔多克隆一抗，4℃过夜，洗去一抗后，加Cy3标记的羊抗兔IgG二抗，孵育60min，加Hoechst33258孵育2min，双蒸水清洗5min，吸干，封片，荧光显微镜分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较应用单因素方差分析，方差齐采用SNK方法，方差不齐采用Krudkal-Wallis H检验。

2 结果

2.1 RT-PCR分析滑膜细胞HMGB1表达情况 RTPCR结果显示，与正常对照组相比，TNF-α刺激滑膜细胞6h后HMGB1 mRNA表达显著增高；而丙酮酸乙酯能降低TNF-α所致滑膜细胞HMGB1 mRNA表达水平，详见图1。

2.2 Western blot检测NF-κB（p65）在滑膜细胞核和细胞质表达情况 Western blot结果显示，正常对照组中，NF-κB（p65）在滑膜细胞核中表达很少，而在细胞质中表达较多；TNF-α刺激30min后NF-κB（p65）在细胞核中表达明显高于对照组，在细胞质中低于对照组；而丙酮酸乙酯使NF-κB（p65）在细胞核中表达减少，而在细 胞质中表达增多，详见图2。

图1 各组滑膜细胞HMGB1表达水平（与正常对照组相比，*P＜0.05；与TNF-组相比，#P＜0.05）

图2 各组滑膜细胞NF-κB（p65）表达水平（A：滑膜细胞核；B：滑膜细胞质；与正常对照组相比，*P＜0.05；与TNF-α组相比，#P＜0.05）

2.3 各组细胞因子IL-6、IL-8、HMGB1含量的比较 ELISA结果显示，TNF-α刺激滑膜细胞24h后，培养上清液中IL-6、IL-8、HMGB1含量显著增多，但丙酮酸乙酯能显著降低IL-6、IL-8、HMGB1的含量，详见表1。

表1 各组细胞因子IL-6、IL-8、HMGB1含量的比较

2.4 细胞免疫细胞化学分析NF-κB（p65）核移位 免疫荧光细胞化学技术显示，正常状态下，NF-κB（p65）位于滑膜细胞质中，滑膜细胞受TNF-α刺激30min后，NF-κB（p65）入核明显增多；丙酮酸乙酯抑制了对TNF-α诱导的NF-κB（p65）核移位，详见图3。

3 讨论

HMGB1是近年来发现的一种重要的晚期炎症介质，在脓毒症等急性炎症的发生、发展中起重要作用[3-6]。近年来研究也表明，HMGB1与RA的发病也密切相关[7]。在RA患者或胶原诱发的关节炎模型中，HMGB1在滑膜组织均有高表达，并且与滑膜炎症和关节破坏密切相关。在小鼠关节腔内注射HMGB1可引起轻、中度滑膜炎症，并诱导滑膜内TNF-α、IL-1和IL-6含量升高；应用HMGB1抗体或重组HMGB1 box A蛋白可缓解动物实验性滑膜炎的病情。因此，以HMGB1为靶点治疗RA是目前研究的策略。

图3 各组滑膜细胞NF-κB（p65）核移位情况

丙酮酸乙酯是一种抗氧化剂和活性氧清除剂，能与过氧化氢发生作用，同时对其它的活性氧基团如一氧化氮、羟自由基等的产生也有抑制作用。研究表明，丙酮酸乙酯可以显著减轻大鼠缺血-再灌注损伤模型动物器官的结构和功能损害，对心、肝、肾等重要生命器官有保护作用[8-9]。丙酮酸乙酯还具有抗炎作用，可调节多种早期炎症介质的表达和释放，在抗脓毒症作用中发挥重要作用，有研究证实，丙酮酸乙脂能减少脓毒症小鼠血液中HMGB1含量，降低实验动物的病死率[10]。最近研究发现，丙酮酸乙酯注射能减轻胶原性关节炎模型（CIA）大鼠或小鼠关节的肿胀程度和关节滑膜的炎症，显著降低大鼠血清中TNF-α、IL-6、MIP和IL-17含量，提高IL-10、TGF-β1含量，表明丙酮酸乙酯在RA等关节炎症性疾病中亦可发挥抗炎作用[11-12]。本研究发现，丙酮酸乙酯能抑制滑膜细胞晚期炎症介质HMGB1的表达和释放，从细胞水平进一步证实丙酮酸乙酯的抗炎作用及机制。

NF-κB通路是调节炎症反应的一条重要信号转导通路。转录因子NF-κB在转录水平参与许多炎症介质基因的表达调节，是引起感染性疾病和自身免疫性疾病发生、发展的重要机制之一[13]。哺乳动物转录因子NF-κB主要是p65和p50亚家族蛋白结合形成的异二聚体。当细胞未受刺激时，NF-κB与其抑制蛋白ΙκB结合，以无活性的复合物形式存在于细胞质中。当细胞受到炎性刺激时，ΙκB被激活，随后发生磷酸化而降解。NF-κB游离出来后活性恢复，然后移位进入细胞核。在细胞核内，NF-κB与相应的靶基因启动子区的κB位点相结合促使炎症介质基因的表达。研究表明，与骨关节炎相比，NF-κB在RA滑膜组织中表达明显升高，而且体外实验也发现滑膜细胞遭受炎症因子刺激时NF-κB活性增强[14]。为了阐明丙酮酸乙酯抑制TNF-α所致的滑膜成纤维细胞HMGB1生成的机制，本研究观察丙酮酸乙酯对TNF-α诱导的NF-κB通路活化的影响。本研究显示，丙酮酸乙酯能够明显抑制NF-κB的核移位，表明丙酮酸乙酯能抑制滑膜细胞NF-κB信号通路的活化而抑制炎症因子HMGB1的产生和分泌。

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Effect of ethyl pyruvate on expression of HMGB1 in synoviocytes of rheumatoid arthritis

ObjectiveTo investigate the effects of ethyl pyruvate(EP)on the expression of high mobility group box chromosomal protein 1(HMGB1)in synoviocytes of rheumatoid arthritis(RA)and its molecular mechanism．Methods RA synoviocytes were cultured and divided into normal control group,TNF-a group,EP+TNF-α group．The expression of HMGB1 mRNA in cultured synoviocytes was determined by RT-PCR．HMGB1 concentrations in culture supernatants were measured with enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA)．Nuclear translocation of NF-κB was examined by Western blotting and immunohistochemistry．Results EP down-regulated HMGB1 mRNA expression and secretion in RA synoviocytes induced by TNF-a．EP inhibited nuclear translocation of NF-κB in RA synoviocytes induced by TNF-α．Conclusion EP has an anti-inflammatory effect on RA by down-regulation of HMGB1 in synoviocytes,which may be associated with inhibiting the activation of NF-κB signal pathways．

Rheumatoid arthritis High mobility group box chromosomal protein 1 Synoviocytes NF-κB Ethyl pyruvate

2014-02-19）

（本文编辑：严玮雯）

台州市椒江区科技项目（122095）

318000 台州学院附属市立医院肾病和风湿免疫科（金小福、蒋琼）；台州学院医学院肿瘤研究所（罗心静）

罗心静，E-mail：luoxjing@126.com