CD97-CD55蛋白复合体在乳腺恶性肿瘤组织中的表达及临床意义

袁晓雷 田华 朱旭明 黄斌 孙丽君 张伟军 王震宇 李锋 陈力

CD97-CD55蛋白复合体在乳腺恶性肿瘤组织中的表达及临床意义

袁晓雷 田华 朱旭明 黄斌 孙丽君 张伟军 王震宇 李锋 陈力

目的 探讨CD97-CD55蛋白复合体在乳腺恶性肿瘤组织中的表达与临床病理因素的关系和评判预后的价值。 方法 收集212例乳腺恶性肿瘤及358例乳腺良性肿瘤组织石蜡标本制备组织芯片，采用免疫组化SP法检测CD97抗原表位CD97EGF、CD97Stalk和CD55的表达，结合临床资料分析其与临床病理因素联系。设计CD97和CD55寡核苷酸探针，应用显色原位杂交技术检测CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、恶性肿瘤组织中的表达。采用Cox比例风险模型分析影响乳腺恶性肿瘤预后风险因素，Kaplan-Meier曲线法进行生存分析。 结果 CD97EGF和CD97Stalk在乳腺恶性肿瘤组织中表达率分别为53．3%（113/212）和65．1%（138/212）。CD55在乳腺良、恶性肿瘤组织中均有表达。显色原位杂交显示CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、恶性肿瘤组织中染色强度差异均有统计学意义（均P＜0．01）。Cox比例风险模型分析显示肿瘤大小、阳性淋巴结转移数目、TNM分期、CD97EGF阳性表达是影响乳腺恶性肿瘤预后的独立危险因子。 结论 乳腺恶性肿瘤组织可检测到CD97-CD55蛋白复合体表达，CD97Stalk和CD97EGF两个不同抗原表位可能在CD97参与肿瘤发生、发展机制中存在着一定的差异。乳腺恶性肿瘤组织CD97EGF阳性表达可作为预后判断指标之一。

肿瘤 乳腺 CD97 CD55 蛋白复合体 组织芯片 免疫组织化学 显色原位杂交

CD97是血管内皮生长因子7次跨膜蛋白（epidermal growth factor-seven-span-transmembrane，EGF-TM7）家族Ⅱ类受体成员之一，分子量约75～90kDa。EGFTM7受体包括一个信号肽，N-末端不同数目的EGF作用功能域，一段具有保守切割位点的茎杆样结构，7次跨膜形成黏液素样茎环结构和C端一个短小的胞内段，目前已证实在胃肠道及甲状腺等多种上皮性肿瘤中有所表达[1]。CD55属于膜结合型补体调节蛋白（membrane-bound complement regulatory proteins，mCRPs），CD97可与细胞间分布较为广泛的CD55相互作用形成蛋白复合体发挥作用[2]。由于N-末端糖基化作用，CD97可形成CD97EGF和CD97Stalk等不同抗原表位，两者的表达特点和分布范围在肿瘤组织和细胞中具有一定的差异性[3]。本研究应用组织芯片技术对CD97EGF、CD97Stalk和CD55在乳腺恶性肿瘤组织中的表达进行检测，结合临床病理资料，探讨其在乳腺恶性肿瘤患者预后判断中的价值，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2007-08—2010-08杭州市萧山区第一人民医院收治的乳腺恶性肿瘤患者212例，其中男1例，女211例，年龄31～81（50.3±4.2）岁。术前患者均未行新辅助化疗及局部放射治疗。绝经前151例，绝经后60例，其中单侧单发207例，单侧多发2例，双侧3例；肿瘤位于右侧102例，左侧107例，双侧3例；肿瘤直径＜1.0cm 15例，1.0～2.0cm 74例，2.0～5.0cm 111例，＞5.0cm 12例。根据2001年中国乳腺肿瘤病理分类[4]，非浸润性癌16例，包括小叶原位癌2例，导管内癌11例，派杰病1例，导管内乳头状瘤局部癌变2例；浸润性非特殊癌180例，包括浸润性癌23例，浸润性导管癌152例，浸润性小叶癌5例；浸润性特殊癌13例，包括黏液腺癌8例，髓样癌3例，鳞癌2例。乳腺间叶组织来源恶性肿瘤3例，包括叶状肉瘤1例，低度纤维母细胞肉瘤2例。TNM分期0期16例，Ⅰ期15例，Ⅱ期106例，Ⅲ期59例，Ⅳ期16例。淋巴结转移182例，共398枚，平均淋巴结转移数目1.87枚/例。收集同期乳腺良性肿瘤358例，均为乳腺单发病灶，其中男3例，女355例，年龄17～75（38.5±2.7）岁。病灶直径＜1.0cm 72例，1.0～2.0cm 177例，2.0～5.0cm 99例，＞5.0cm 10例。病理类型包括乳腺纤维瘤206例，导管内乳头状瘤12例，单发乳腺囊性增生症41例，乳腺增生症伴瘤样增生65例，乳腺积乳囊肿10例，乳腺导管扩张症伴囊肿形成15例，乳腺脂肪瘤7例（其中男性3例），乳腺良性分叶状肿瘤2例。

1.2 主要试剂和仪器 Anti-CD97EGF单克隆抗体（VIM-3b）及Anti-CD97Stalk单克隆抗体（MEM-180）均购自美国BD PharMingen公司，Anti-CD55鼠单克隆抗体（BRIC 216）购自美国Abcam生物公司，显色原位杂交试剂盒购自德国Zytovision公司，组织芯片制备仪购自北京博医康实验仪器有限公司，CD97、CD55探针由武汉Stargene公司依据CD97蛋白基因序列（Gene Bank NM_001025160）及CD55蛋白基因序列（Gene Bank NM_001114752）应用TaqMan技术进行设计合成制备。

1.3 乳腺良、恶性肿瘤组织石蜡标本组织芯片制备采用低密度组织芯片共上样45个点（横轴9个点×纵轴5个点），分别制作乳腺良、恶性肿瘤组织芯片进行实验。制备石蜡标本固定保存，编号备案。组织芯片仪进行打孔，柱状石蜡组织条取样置入受体蜡块孔。制作完成的组织芯片蜡块置于37℃烤箱中15min，-20℃冰箱低温保存2h，修块、切片，捞片后65℃烘烤10min，与载玻片紧密粘连后进行HE、免疫组织化学染色及显色原位杂交实验。

1.4 CD97EGF、CD97Stalk及CD55在乳腺良、恶性肿瘤组织中的表达 采用SP法进行组织芯片免疫组织化学染色，乳腺良、恶性肿瘤组织芯片实验应用抗体滴度分别为：anti-CD97Stalk1∶400、anti-CD97EGF1∶400、anti-CD55 1∶200。主要实验步骤：组织芯片切片，常规脱蜡水化，微波修复抗原15min，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶活性30min，滴加正常血清孵育，依次加入上述目标抗体4℃过夜，生物素标记37℃30min，辣根酶标记链霉卵白素30min，DAB显色，苏木精复染，脱水封片。染色结果采用半定量计数方法[5]，由2位高级职称病理医师在光镜下进行结果判定，计数方法：IRS=SI×PP（SI为阳性细胞染色强度，PP为阳性细胞百分率），SI分为4个等级：0为阴性，1为弱阳性，2为中度阳性，3为强阳性；PP＜10%为1,10%～50%为2,51%～80%为3，＞80%为4。IRS乘积最高值为12，≤3分为阴性，＞3分即为阳性，4～8分为中度阳性，＞8分为强阳性；以中度阳性和强度阳性计算阳性率。

1.5 CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、恶性肿瘤组织中的表达 采用显色原位杂交检测。依据Gene BankCD97及CD55基因序列信息选择目标序列应用Taqman技术合成CD97及CD55的寡核苷酸探针引物。CD97引物探针序列：GTCTGGCTGA/421/CTCTGCCGGGAGCTGAAACCAGGACTCCAGGGGCTGTGCCCGGTGGTGCCCTCAGAACT/482/CCTCGTGTGTGTCAATGCCA-CCGCCTGTCGCT GCAATCCAGG GTTCAGCTCT TTTTCTGAGA；CD55引物探针序列：CD55上游引物：GTGCCGTCCAGGTTACAGAA；CD55下游引物：TCTCCCGGATTAGGGCATGA。引物合成后经检测合格后予以应用。CISH法检测CD97及CD55基因扩增参照显色原位杂交试剂盒说明书略加改进后进行。主要实验步骤：脱蜡，蛋白酶37℃孵育消化10min，乙醇逐级脱水，适量体积的杂交缓冲液42℃预热杂交30min，68℃新鲜变性10min，含有地高辛标记探针杂交液42℃湿盒过夜，洗涤65℃预热10min，加地高辛抗体杂交后洗涤3min，100μl封阻液孵育30min，检测缓冲液平衡5min，加入底物显色液15～30min（100μl/张切片），显微镜下掌握染色程度用无菌双蒸水终止染色。染色强度（颗粒数）检测结果参照乳腺癌HER2基因检测指南进行染色结果判断[6]。

1.6 恶性肿瘤的随访 采用电话及门诊复查方式进行随访，随访时间24～60个月，平均38.3个月；212例患者中失访9例，随访率为95.75%。术后2年内每3个月检查1次，以后每半年检查1次，检查内容包括健侧乳房、胸部CT、肝脏B超及头颅CT等，自手术始至首次复发间隔为无病生存时间（disease-free survival，DFS），随访DFS并作为预后判断指标。

1.7 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件。计数资料的比较及分析采用χ2检验；乳腺恶性肿瘤中CD97和CD55阳性表达的关系采用Spearman相关性分析；乳腺良、恶性肿瘤组织中CD97和CD55表达强度的比较采用t检验。采用Cox比例风险模型分析影响预后的风险因素，Kaplan-Meier曲线法进行无病复发生存分析，log-rank检验比较CD97Stalk、CD97EGF两组累积生存率。

2 结果

2.1 CD97和CD55在乳腺良、恶性肿瘤组织中的表达CD97Stalk阳性染色呈棕黄色染色颗粒表达于乳腺恶性肿瘤细胞质及细胞膜，且分布呈一定的极性改变，多位于靠近肿瘤纤维基质（图1，见插页），在乳腺恶性肿瘤组织中的阳性率为65.1%（138/212），在乳腺良性肿瘤组织中阳性率为25.9%(93/358)，两者差异有统计学意义（P＜0.01）。CD97EGF阳性染色呈棕黄色染色颗粒表达于乳腺恶性肿瘤细胞质和细胞膜（图2，见插页），在乳腺恶性肿瘤组织中阳性率为53.3%（113/212），在乳腺良性肿瘤组织中阳性率为12.0%（43/358），两者差异有统计学意义（P＜0.01）。CD55在良、恶性肿瘤组织中均有表达，呈棕黄色染色于癌细胞质，围绕腺管上皮细胞周围，部分腺管管腔内着色（图3，见插页），在乳腺恶性肿瘤组织组中阳性率为65.1%（138/212），在乳腺良性肿瘤组织中阳性率为87.9%（315/358），两者差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 CD97mRNA和CD55mRNA在乳腺良、恶性肿瘤组织中的表达 CD55mRNA原位杂交显色多分布于肿瘤细胞质和基质中，在乳腺恶性肿瘤组织细胞中可见较多扩增表达，苏木精染色胞核呈深紫染色（图4，见插页）。乳腺良、恶性肿瘤组织均有不同程度的CD97mRNA原位杂交显色信号，良性组织中分布于细胞质，苏木精染色胞核呈淡紫染色（图5，见插页），恶性组织中分布于肿瘤细胞质，苏木精染色胞核呈深紫染色，多发生在成簇肿瘤细胞，可见较多扩增表达（图6，见插页）。显色原位杂交信号强度（颗粒数）比较结果显示，CD97mRNA在乳腺良性肿瘤组织中为2.45±0.30，恶性肿瘤组织中为3.75±0.15，差异有统计学意义（t=2.476，P＜0.01）；CD55mRNA在乳腺良性肿瘤组织中为2.60±0.75，恶性肿瘤组织中为3.10±0.80，差异无统计学意义（t=0.973，P＞0.05）。

2.3 乳腺恶性肿瘤组织CD97和CD55阳性表达的相关性分析 CD97EGF和CD55两者在乳腺恶性肿瘤组织表达呈正相关（r=0.318，P＜0.05），CD97Stalk和CD55两者在乳腺恶性肿瘤组织中表达呈正相关（r=0.305，P＜0.05）。

2.4 CD97、CD55表达与乳腺恶性肿瘤临床病理特征比较 乳腺恶性肿瘤组织中CD97EGF、CD97Stalk以及CD55的表达和临床病理特征单因素分析结果详见表1。结果显示：（1）CD97EGF在乳腺恶性肿瘤组织中的表达与肿瘤大小、病理类型、病理分期、组织学分级等各因素的差异有统计学意义（P＜0.05）；（2）CD97Stalk在乳腺恶性肿瘤组织中的表达与病理类型、病理分期以及淋巴结转移状态等各因素的差异有统计学意义（P＜0.05或0.01）；（3）CD55在乳腺恶性肿瘤组织中的表达与病理类型、组织学分级及淋巴结转移状态的差异有统计学意义（P＜0.05）。根据结合乳腺恶性肿瘤改良根治术后随访患者生存资料进行的Cox比例风险模型分析结果，进一步提示肿瘤大小（HR=1.206，P＜0.05）、阳性淋巴结转移数目（HR=1.332，P＜0.05）、TNM分期（HR=2.015，P＜0.05）、CD97EGF阳性表达（HR=10.481，P＜0.05）是影响乳腺癌预后的独立危险因子，详见表2。

2.5 CD97EGF阳性表达与乳腺恶性肿瘤患者预后关系CD97EGF阴性组60个月随访时间段内的总体无病生存率为86.86%（86/99），CD97EGF阳性组为62.8%（71/113），结合随访无病生存资料应用Kaplan-Meier法进行分析比较显示，CD97EGF阴性组无病生存率优于阳性组，log-rank检验结果显示有明显差异（P＜0.05），随着CD97EGF表达的增强，总体生存曲线有下降的趋势（图7），CD97Stalk表达组间无病生存率比较差异性不明显。

表1 乳腺恶性肿瘤组织CD97Stalk、CD97EGF表达和临床病理特征比较（例）

表2 乳腺恶性肿瘤患者多元回归Cox比例风险模型预后分析

图7 乳腺恶性肿瘤组织CD97EGF表达生存分析曲线

3 讨论

1997年德国哈勒大学Hoang-Vu等[7-8]研究证实甲状腺恶性肿瘤组织中CD97的表达强弱与肿瘤细胞的侵袭性和淋巴细胞的转移程度有关，是甲状腺癌去分化程度的肿瘤标记物，从此开启了CD97在上皮性恶性肿瘤中研究。在大肠癌研究中发现，大肠恶性肿瘤边缘组织癌细胞CD97阳性表达水平强弱与肿瘤细胞淋巴管浸润和临床肿瘤分期呈显著正相关[9]；在食管癌、胰腺癌、口腔黏膜鳞状上皮癌等上皮组织来源的恶性肿瘤中如CD97表达水平与肿瘤患者的临床病理学特征之间存在相关性[10-11]，证实CD97阳性表达与恶性肿瘤的分化、浸润、转移和临床分期有关，是肿瘤治疗和预后的重要靶分子。在肿瘤细胞中的表达研究结果显示，CD55广泛分布于胃肠道上皮来源恶性肿瘤，在腺管管腔上皮细胞中呈极性化分布，在肿瘤基质和周围正常结缔组织中过表达，提示CD55在肿瘤发生、发展过程中具有细胞信号传导作用，并参与肿瘤微环境的形成。CD55通过影响C3/C5转换酶的形成，抑制同源补体级联反应和下游效应子的激活，可非特异性抑制自然杀伤细胞的作用使肿瘤细胞逃避人体自身免疫系统的免疫攻击[12]。CD97和CD55以受体-配体的形式相互作用参与甲状腺、胃肠道、前列腺等多种上皮性来源恶性肿瘤细胞在肿瘤的分化、迁移、浸润以及转移机制中扮演了重要角色[3，10]。由于N-末端糖基化作用等因素影响，CD97形成CD97EGF和CD97Stalk等两类不同免疫表位，对首个EGF区域结合的CD97EGF单克隆抗体染色比茎环区域结合的CD97Stalk单克隆抗体具有更严格的限制性，两者的表达特点和分布范围具有差异性。

上皮生长因子EGF受体在多种实体肿瘤细胞中表达异常或呈高表达，与肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及抑制凋亡等机制相关，EGF受体与配体相互作用促进肿瘤细胞的异常增殖，提示预后不良[13]。本研究结果显示，CD97EGF和CD97Stalk均呈棕黄色染色阳性表达于乳腺恶性肿瘤细胞质和细胞膜，CD97Stalk染色阳性细胞分布呈一定的极性改变，多分布于靠近肿瘤纤维基质；CD55阳性表达于癌细胞质，呈棕黄色染色，围绕腺管上皮细胞周围分布。原位杂交显色实验结果显示，CD97mRNA分布于肿瘤细胞质，多发生在成簇肿瘤细胞，在乳腺恶性肿瘤组织细胞中可见较多扩增表达，HE染色胞核呈深紫染色，显色原位杂交信号强度（颗粒数）比较结果显示在乳腺良、恶性肿瘤组织存在扩增表达，与乳腺良性肿瘤组织中的差异均有统计学意义（均P＜0.01）。结合乳腺恶性肿瘤改良根治术后患者随访无病生存时间资料进行的Cox比例风险模型分析，结果表明肿瘤大小、阳性淋巴结转移数目、TNM分期、CD97EGF阳性表达是影响乳腺癌预后的独立危险因子。Kaplan-Meier曲线法生存分析显示CD97EGF表达阳性在乳腺癌患者中无病生存预后相对较差。

研究显示，CD97EGF在胃癌肿瘤组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达特点和文献报道的CD97Stalk在大肠肿瘤中表达特点有显著不同，CD97EGF在癌旁组织和正常组织的表达水平可作为判定胃癌组织潜在分子切缘，而CD97Stalk强阳性染色于肿瘤浸润前沿散在分布的单个瘤细胞和小的肿瘤细胞群[11，14]。本研究采用制备乳腺良、恶性肿瘤组织芯片作为实验平台对CD97-CD55蛋白复合体在乳腺恶性肿瘤组织中的表达进行测定，选择CD97EGF和CD97Stalk两类不同免疫表位单克隆抗体进行相关实验，在乳腺恶性肿瘤组织中均可检测到CD97EGF、CD97Stalk和CD55的表达，CD97和CD55在乳腺恶性肿瘤组织中的表达存在明显的相关性，研究结果进一步扩充了CD97在上皮来源恶性肿瘤中的表达谱，提示以配体和受体相互作用形式存在的CD97-CD55蛋白复合体在恶性肿瘤组织中的表达具有一定的普遍性。CD97Stalk和CD97EGF免疫组织化学染色分布特点提示两个CD97不同免疫表位参与乳腺恶性肿瘤发生、发展机制中可能存在差异。CD55属于膜结合型补体调节蛋白，可保护宿主细胞免遭补体的攻击，CD55通过影响C3/C5转换酶的形成，加速C3/ C5转换酶的消亡，可非特异性抑制自然杀伤细胞的作用而肿瘤细胞逃避人体的自身免疫系统的免疫攻击[15]。CD97和CD55相互作用可进一步避免恶性肿瘤细胞被自然杀伤细胞的攻击，在恶性肿瘤的微环境条件下为逃避补体对乳腺恶性肿瘤免疫摧毁和为潜在转移扩散创造一定的条件[2，16-17]，进一步的潜在机制有待进一步深入研究。

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（本文编辑：严玮雯）

《浙江医学》对计量单位的要求

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本刊编辑部

Expression of CD97-CD55 protein complex in patients with breast malignant tumors and its clinicopathological significance

ObjectiveTo detect the expression of CD97-CD55 protein complex in breast malignant tumors and to assess its clinicopathological significance．Methods CD97-CD55 protein complex was detected in 212 paraffin specimens of breast malignant tumor tissue and 358 specimens of breast benign tumor tissue immunohistochemially by tissue micro-array chip method．The diversity of CD97 and CD55mRNA expression in benign and malignant breast tumor tissues was also detected by CD97 and CD55 oligonucleotide probe with chromogenic in situ hybridization method．The risk factors were analyzed by Cox proportional risk model and multiple regression analysis method,and Kaplan-Meier curve was adopted for survival analysis．Results CD97EGFand CD97Stalkexpressions were detected in 53．3%（113/212）and 65．1%（138/212）of breast malignant tissue,respectively．CD55 expression was detected both in benign and malignant tumor tissue．CD97 and CD55mRNA in breast malignant tumor tissue shown a visual amplification by chromogenic in situ hybridization method,and there was a significant difference compared to that in benign breast tumor tissue(P＜0．01)．Cox proportional risk model and multiple regression analysis showed that tumor size,positive axillary lymph node numbers,TNM classification and positive-CD97EGFexpression were independent risk factors for prognosis of patients with breast malignant tumor．Conclusion CD97-CD55 protein complex are expressed in breast malignant tumor tissue．CD97Stalkand CD97EGFmay play a different role in tumorogenesis and progression of breast malignant tumor．CD97EGFpositive expression in breast malignant tumor tissue can be used as an indicator for prognosis estimation．

Neoplasma Mammary gland CD97 CD55 Protein complex Tissue micro-arrary Immunochemistry Chromogenic in situ hybridation

2013-11-18）

杭州市医药卫生科技计划项目（2008102147）

311200 杭州市萧山区第一人民医院普外科（袁晓雷、田华、朱旭明、黄斌、孙丽君、张伟军、王震宇、李锋）；浙江大学医学院附属第二医院外科（陈力）

陈力，E-mail：chenli@mail.hz.zj.cn