酵母双杂交及其衍生系统

酵母双杂交及其衍生系统

黄欣媛1范红波2
（1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000；2.湖北职业技术学院，孝感 432000）

酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去20多年里，大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。

酵母双杂交系统 蛋白质相互作用 双杂交技术体系

生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的基础，在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生物学的一个主要目标。1989年诞生的酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）系统以及随后出现的各种衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和RNA、小分子化合物之间相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在细胞信号转导、蛋白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。本文对Y2H系统的基本原理、衍生系统和应用进展等方面进行介绍。

1 酵母双杂交系统的原理

酵母GAL4转录因子由两个可以分开的结构域组成：DNA结合域（DNA binding domain，BD）负责结合基因的上游激活序列，将转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到启动子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活基因转录，只有BD和AD通过一定方式在空间上足够靠近，才能发挥完整的GAL4转录因子活性。基于此特点，Fields和Song［2］设想以一对能相互作用的蛋白质为桥梁，将空间上分开的BD和AD彼此拉近，从而重建出具有活性的转录因子，以此创立了Y2H系统。在该系统中，将BD和AD基因分别和诱饵蛋白（Bait）和猎物蛋白（Prey）基因构建成融合蛋白表达载体，使其在酵母中共表达出BDBait和AD-Prey，借助Bait和Prey的物理性相互作用使BD和AD相互靠近而产生具有功能的转录因子，进而激活1个或多个报告基因（如lacZ、HIS3和URA3等）的转录。

2 酵母双杂交系统的衍生系统

Y2H系统是在酵母菌这种真核细胞环境中研究

蛋白相互作用的一种技术，具有操作简便、无需繁琐的蛋白纯化操作、可以检测较弱的相互作用等优点［3］。但是也存在假阳性率较高（检测到的相互作用有20%-50%在真正生理环境下并不发生［4］）、技术灵敏度较低（一次检测只能涵盖5%-20%的真正相互作用［5］）等缺陷。针对此，很多学者不断改进试验设计和操作技术，开发出许多衍生系统，提高了传统Y2H系统的灵敏度和特异性，极大地扩展了Y2H系统的应用范围。

2.1 筛选模式的多元化

在Vidal等［6］建立的反向双杂交系统（Reverse two-hybrid system）中，使用URA3作为报告基因，其表达产物对酵母菌具有毒性，使其不能生长。当Bait和Prey没有相互作用或互相解离时，毒性报告基因不表达，菌株能正常生长。这种反向筛选（负筛选）法可鉴定出阻断蛋白间相互作用的因子，在研究蛋白质重要结构域和作用位点以及影响蛋白质结合或解离的因素等方面发挥重要作用［7］。

研究蛋白质-DNA相互作用的酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）［8］的原理在于：Prey蛋白可直接与DNA相结合，使得与Prey融合的AD激活报告基因的表达，而无需BD-Bait蛋白参与，故被命名为“单”杂交系统，它为转录因子的分离鉴定研究提供了有效方法［9］。

某些蛋白质的相互作用需要第三个分子如小分子配体、RNA等来介导，三杂交系统（Three-hybrid system）［10］就是研究这些第三分子的技术。第三分子通过对Bait或Prey蛋白进行修饰，或诱导其构象发生改变，从而使两者产生相互作用，进而激活报告基因表达。

双诱饵酵母双杂交系统（Dual bait yeast twohybrid system）［11］在同一酵母细胞中转入一个ADPrey和两个不同的BD-Bait，如果一个Bait与Prey之间有相互作用，则可激活该Bait对应的报告基因的表达，两个Bait都可以和Prey作用的话就会激活所有报告基因。它的优点是仅一次实验就能同时进行两次独立筛选，并可比较出这两对蛋白结合能力的差异。该系统被成功地应用于研究靶蛋白上的作用位点，以及药物对蛋白互作的破坏作用［12］。

2.2 报告基因的改进

多个报告基因的引入有利于提高Y2H技术的灵敏度和选择性，如广泛应用的PJ69-4A酵母菌株［13］包含HIS3、ADE2和lacZ三个报告基因。Shaffer等［14］以此酵母菌为基础，改造成BAPJ69-4A菌株，加入URA3作为第4个报告基因，使得基于该菌株的Y2H既可用于正筛选，也可用于负筛选。

lacZ报告基因的转录主要靠定性或定量的β-半乳糖苷酶活性分析来检测，需要使用发色底物X-Gal，而荧光蛋白作为报告蛋白的优点在于不需要添加额外的底物，可以通过流式细胞术直接检测并分离出阳性细胞，无需繁琐的选择性培养基筛选操作。如Chen等［15］将酵母加强绿色荧光蛋白（Yeast enhanced green fluorescent protein，yEGFP）基因、Damon等［16］将加强黄色荧光蛋白（Enhanced yellow fluorescent protein，eYFP）基因作为报告基因引入Y2H系统，可用荧光显微镜观察报告蛋白的表达，并可方便地应用流式细胞仪来鉴定筛选蛋白质相互作用［17］。

2.3 载体构建策略的改进

在表达载体构建上的一些改进措施可以降低Y2H系统的假阳性和假阴性率。传统Y2H系统中构建的融合表达载体是将Bait或Prey蛋白与BD或AD的N端融合，Stellberger等［18］设计了两个新载体：pGBKCg和pGADCg，分别用于将BD的C端和Bait，以及AD的C端和Prey蛋白融合。在Y2H筛选中，将这两个载体和已有的两种N端融合载体联用，可形成4种不同的Bait-Prey作用组合，即NN、NC、CC和CN。经过对水痘带状疱疹病毒的70种蛋白质组合成的约4 900个候选作用配对进行测试发现，综合使用4种载体组合所筛选到相互作用是传统Y2H使用单一NN组合的两倍，显著降低了假阴性率。此外，各组合得到的相互作用结果还可以互相印证，进一步削减了假阳性率［19］。

2.4 宿主系统的扩展

细菌双杂交和哺乳动物双杂交的出现将Y2H的宿主由酵母细胞扩展到细菌和哺乳动物细胞内。细菌双杂交系统（Bacteria two-hybrid system）由Karimova等［20］设计，利用腺苷酸环化酶缺陷型大

肠杆菌中Bait和Prey蛋白的相互作用，重建腺苷酸环化酶催化功能，引起cAMP的合成，进一步活化cAMP/CAP依赖型启动子，激活报告基因转录进而引发信号转导级联反应。该系统最大优点是细菌的转化效率比酵母更高，可综合性分析更大更复杂的蛋白互作网络，因而得到了广泛应用［21］。如Kim等［22］利用细菌双杂交筛选出人CPI-17蛋白的14个作用蛋白，其中桥粒斑珠蛋白可能参与CPI-17介导的内皮细胞骨架重组。经Battesti等［23］改良的细菌双杂交系统可适用于研究带标签的重组蛋白，而且可方便地将其基因转移到带有6-His、钙调蛋白结合肽或pBAD标签的载体上，更利于蛋白质的亲和纯化。

酵母属低等真核生物，对蛋白质的翻译后修饰水平有限，某些蛋白质在酵母中不能被糖基化、磷酸化或不能正确折叠。哺乳动物双杂交系统（Mammalian two-hybrid system，M2H）可适用于检测相互作用依赖于翻译后修饰的蛋白质［24，25］。其基本原理和Y2H系统类似，借由Bait和Prey在哺乳动物细胞中相互作用而激活报告基因的表达。哺乳动物双杂交系统内容丰富，各方法采用的表达载体、宿主细胞以及报告基因等种类各异，如MAPPIT系 统（Mammalian protein-protein interaction trap system）［26］利用的是哺乳动物细胞中由蛋白相互作用引起的STAT转录因子的激活；trM2H系统（Tetracycline repressor-based mammalian two-hybrid system）［27，28］利用HEK293细胞中四环素阻遏蛋白因为Bait-Prey相互作用而形成二聚体，再和四环素操纵基因结合，进而激活报告基因GFP（绿色荧光蛋白）表达。哺乳动物双杂交系统目前仍在不断完善和发展中，广泛应用于多种哺乳动物蛋白互作研究［29］。如Guo等［30］利用M2H系统发现了p300蛋白的Ser12以及CBP蛋白的Ser92磷酸化位点分别是调节二者和β-catenin之间相互作用的重要位点。

2.5 核外双杂交系统

传统Y2H检测的相互作用发生在酵母细胞核中，而SOS募集系统（SOS recruitment system）［31］、分裂泛素系统（Split ubiquitin system）［32］以及分裂TEV蛋白酶系统（Split TEV protease system）［33］等核外双杂交系统把相互作用场所转移到了细胞核外。SOS募集系统利用待测蛋白的相互作用，将SOS蛋白从胞浆中募集到细胞膜上，激活RAS信号通路，使得温度敏感型宿主酵母菌株可以在37℃生长。该系统可用于研究膜蛋白以及在胞浆中行使功能的蛋白质，如研究拟南芥PEPINO/PASTICCINO2蛋白的膜定位［34］，水疱性口炎病毒核衣壳蛋白在HeLa细胞胞浆中的互作蛋白［35］等。

分裂泛素系统［32］将整合在膜上的Bait与泛素的C半段以及一个转录因子构建成融合蛋白，Prey融合于泛素的N半段，Bait和Prey二者的互作将重建出完整泛素分子，使其被胞浆的泛素降解酶识别并切割，释放出和泛素C半段融合的转录因子，进而激活报告基因表达。该系统具有高度的适用性，在研究多种生物的膜蛋白互作中发挥重要作用［36］，如Harty等［37］用该系统分析了内质网膜上蛋白易位通道蛋白Sec61和Ssh1蛋白的相互作用。

由Wehr等开发的分裂烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）蛋白酶系统［33］利用蛋白互作重建TEV蛋白酶活性，裂解作为报告蛋白的荧光或发光蛋白原，使其发光进而被检测到。该系统适用于检测哺乳动物细胞胞浆和细胞膜上的蛋白相互作用［38，39］。Gray等［40］用该系统研究了人肾上皮细胞中凋亡相关的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶caspase-3、-6和-7的功能，结果显示三者都被短暂地激活，但是只有caspase-3或-7能够诱导凋亡的发生。

2.6 定量分析技术

Y2H技术的优点之一就是可以对相互作用强度进行定量/半定量检测，主要原理是检测报告基因的激活程度。目前主要的定量方法有β半乳糖苷酶（lacZ基因编码产物）活性分析［41］，酵母菌生长曲线分析（利用HIS3基因产物影响酵母在SDHis培养基中的生长状态）［42，43］，荧光报告蛋白荧光强度检测［15］等。这些方法均检测的是报告基因转录后被翻译而成的蛋白质产物的数量，由于一些mRNA/蛋白稳定性以及翻译活性是可变的，检测蛋白质水平不一定能真实反映出基于报告基因转录活性的mRNA水平。因此Maier等［44］利用实时定量PCR（QT-PCR）法对Y2H系统中报告基因转录成的mRNA表达水平进行定量检测，经验证比传统Y2H

的灵敏度更高，部分解决自激活（单独的Bait融合蛋白激活报告基因转录）和假阴性问题，可用于检测普通Y2H系统不适用的蛋白相互作用。

2.7 有关试验操作方法的改进和探讨

在试验操作方法上做一些改进可以提高Y2H的筛选效率。提高酵母转化率会提升杂交信号的强度，更加有利于筛选。Lin等［45］改进了酵母的醋酸锂电转化法，使用标准浓度5倍的转化试剂，即0.5 mol/L的LiAc、50 mmol/L Tris-HCl和5 mmol/L EDTA（pH 7.5），对Y2H常用的3种酵母菌株进行电转化试验，结果使转化率显著提升到1.84×106转化子/μg DNA。

不同实验室由于使用不同的双杂交系统，或不同载体、菌株和报告基因，造成各自结果之间差异很大［46］。Liu等［47］的研究表明，培养基的不同配制方法和酵母氮源的来源不同也会影响信号的强度，以及结果是否呈现为阳性或阴性，因而认为更换培养基配方可能会减少各独立试验之间的信号差异，研究报告中培养基配制方法必须详细描述以利于不同试验结果的准确对比和进行重复研究。

在大规模的Y2H矩阵筛选操作方面，为使结果更加严谨，Worseck等［48］提出以下要求：（1）载体上使用很弱的启动子，使Bait和Prey融合蛋白极低水平表达，即用Western Blot检测酵母总蛋白裂解液也不能够检出；（2）使用最严谨的报告基因（如HIS3），即使是长期培养后，报告基因也不能在没有Prey-Bait相互作用时激活；（3）为检测较弱的相互作用，试验操作中必须使用新鲜的酵母菌，并进行重复试验。

3 酵母双杂交的应用

Y2H及其衍生系统的应用范围广泛，由最初的研究蛋白质之间相互作用扩展到研究蛋白质和DNA、RNA以及其他小分子等配体间的相互作用。在细胞信号转导、免疫学、病理学以及蛋白质组学等领域发挥重要作用。

3.1 筛选已知蛋白质在cDNA文库中的相互作用对象应用Y2H系统筛选cDNA文库中和已知蛋白有相互作用的蛋白质已经成为研究已知蛋白新功能主要途径。主要操作流程为：以已知蛋白作为Bait，在指定的cDNA文库中筛选出有报告基因激活的阳性酵母克隆，从中分离纯化出Prey载体，测定其DNA序列，在GeneBank中获取该序列信息，即可获知Prey蛋白的相关信息。Yoon等［49］用Y2H系统筛选出拟南芥中赤霉素受体GID1直接作用的信号转导蛋白DELLA，以及一种抑制这种相互作用的化合物：TSPC（3-（2-thienylsulfonyl）pyrazine-2-carbonitrile），该研究对于研究植物中赤霉素信号通路具有重要意义。Kim等［50］为研究黑腹果蝇中刺激转录延伸的关键因子Cyclin T/CDK9异源二聚体的组装方式，利用大规模Y2H筛选法鉴定出该复合物的温度敏感型变异体，表明两者结合的关键在两者作用界面的α2和α3螺旋上，该突变体通过影响Cyclin T的构象直接或间接干扰Cyclin T和CDK9的结合。

3.2 绘制蛋白质相互作用网络图谱

机体内蛋白质之间的复杂的相互作用网络是相互作用物组（Interactome）的一个重要组成部分，对该网络作图也是蛋白质组学的重要研究内容。目前开发出的一些高通量Y2H方法，可以对多达数千的候选蛋白进行筛选，是绘制蛋白质相互作用网络图谱的重要手段。在这一技术的辅助下，一些模式生物的蛋白互作组草图相继被绘制，如：酵母［51，52］、黑腹果蝇［53］、人类［54，55］及秀丽新杆线虫［56］等。现今对蛋白互作组图谱的描绘越来越精细，如对胞内核心信号通路——MAPK信号通路所涉及的蛋白互作网络进行分析，对于更好地揭示细胞信号转导机制具有重要意义。Bandyopadhyay等［57］用Y2H筛选出人MAPK相关蛋白和其他胞内蛋白之间的2 269对相互作用，对其进行作图，经分析发现其中641对互作在酵母中也存在，这种保守性证明这些作用对在信号网络中起核心作用。Singh等［58］也对水稻的MAPK互作组进行了系统性的图谱绘制，找出了MAPK的74个非冗余作用对象，对这些蛋白进行基因本体分类分析发现其归属于34种功能类别，提示MAPK参与多种重要生理功能。

3.3 研究疾病作用原理

利用Y2H系统研究一些疾病相关蛋白的作用靶标可以为更好地揭示疾病的发病机制提供思路。Chen等［59］发现被SARS病毒侵染的宿主细胞中，

病毒的解螺旋酶可以和Ddx5（Asp-Glu-Ala-Asp box polypeptide 5）蛋白结合，抑制Ddx5的表达可以抑制SARS病毒的复制，提示Ddx5在SARS病毒-宿主相互作用中起重要作用。Silva等［60］利用Y2H系统筛选出登革热病毒糖蛋白NS1在人肝脏中的一个新作用蛋白C1q，后续试验表明，NS1和C1q的作用在补体系统和登革热病毒感染病理进程中起重要作用。

在癌症机理研究方面，Lopez-Mateo等［61］利用Y2H筛选出抑癌蛋白p53的一个作用蛋白：转录因子CREBZF。CREBZF的表达可增强p53的转录活性，保护HCT116细胞免受紫外线诱导的细胞死亡，还使得细胞对5-氟尿嘧啶这种能活化p53的抗癌化学治疗药物敏感，提示CREBZF对p53的抑癌活性起正调作用，是一个重要的癌症调节因子。

3.4 筛选药物作用靶点以及新药开发

Y2H及其衍生系统在药物研究方面有着非常广泛的应用，如筛选和验证药物的作用靶点、研究药物对蛋白互作的调控作用、筛选和设计新药等［62］。在研究抗体性药物的作用位点方面，Vielemeyer等［63］报道了以Y2H技术为基础的一种高效的方法：以单链抗体（scFv）作为Bait，筛选高复杂度的cDNA文库，对得到的cDNA片段进行多重比对可获知其上的选择性相互作用域（SID）信息，从而高效地定位抗体靶标蛋白上的表位区域。他们筛选到AA2和ROF7这两种scFv的专一性作用靶标：小GTP酶Rab6和Rab1。这种结合具有构象特异性，只有当靶标蛋白包含整个SID核心区域才能够被筛选到。由此可见，该方法具有很高的特异性。也可将已知蛋白作为Bait，筛选与之结合的scFv。如Ding等［64］成功筛选出3种与人IL-8特异性结合的scFv。

在抗病毒药物开发方面，Urano等［65］利用SOS募集系统从20 000个候选的小分子中筛选出抑制人免疫缺陷病毒（HIV）Gag蛋白装配的化合物BMMP（2-（benzothiazol-2-ylmethy-lthio）-4-methylpyrimidine），若以BMMP为基础，可设计开发出新的抗HIV病毒药物。

4 结语

Y2H是试验技术发展和酵母遗传学相结合的产物，其原理在于通过一对蛋白的相互作用将转录因子活性进行重建，这种自我重组装/功能重建的概念催生了一大批相关的衍生技术，揭示了细胞中大量复杂的生物大分子互作网络，为进一步解码这些作用网络的功能提供基础［66］。这些相关的改进包括：设计新的筛选方案、改进载体和菌株、使用酵母以外的生物作为宿主、反向筛选法、分析蛋白质和DNA、RNA或其他配体相互作用、检测胞浆或细胞膜上蛋白互作、开发其他的可以被分裂拆开的报告蛋白（如泛素、荧光蛋白、荧光素酶和腺苷酸环化酶等）等。Y2H及其衍生系统共同组成一套内容丰富的“双杂交”技术体系，是研究生物大分子相互作用的重要手段。Y2H系统创始人Fields展望了这一技术体系的前景［66］：随着试验技术的进步和研究者的不断努力，以及生物分子优良的工具属性被深入揭示，双杂交这一技术体系会不断向前发展，内涵会更加丰富，应用平台会更加广阔。

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（责任编辑 狄艳红）

The Yeast Two-Hybrid System and Its Several Derived Systems

Huang Xinyuan1Fan Hongbo2
（1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables，Hubei Engineering University，Xiaogan 432000；2.Hubei Polytechnic Institute，Xiaogan 432000）

The Yeast two-hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein-protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two-hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein-ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques.

Yeast two-hybrid（Y2H）system Protein-protein interaction Two-hybrid methodology system

2013-08-03

特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）

黄欣媛，女，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：huangxycn@gmail.com