Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子家族及其在疾病发生中的作用

Rho 鸟嘌呤核苷酸交换因子家族及其在疾病发生中的作用

刘明涛1杨军2王志钢1
（1.内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021；2. 呼和浩特市环境科学研究所，呼和浩特 010030）

Rho GTP酶（Rho GTPase）家族在真核生物细胞中参与细胞骨架调节、基因转录、膜泡运输等过程，扮演着分子开关的角色。Rho型鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEF）是调节Rho GTPase 活性的关键因子，在Rho GTPase信号调节、组织器官的生长发育及免疫应答中起着至关重要的作用。RhoGEF与肿瘤、发育及神经类疾病、病原微生物感染等也有密切关系，对其功能的深入了解有助于人们认识某些生理和病理现象的发生机制。

Rho GTPase 鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF） 疾病发生

在真核生物中，普遍存在着一种能够与三磷酸鸟苷（GTP）结合的蛋白家族，我们称之为小G 蛋白家族（small GTPase family）。随着研究的深入，小G蛋白又可分为Ras（大鼠肉瘤）、Rho（Ras相似物）、Rab（Ras-like in rat brain）、Arf /Sar（装配反应因子）和Ran（Ras相关核蛋白）等5个亚家族。Rho GTPase在调节细胞骨架形成、基因转录、细胞周期及膜泡运输中起着重要的作用，与肿瘤及神经性疾病的发生也有密切关系，在体内扮演着分子开关的角色。这种作用是通过GTP与二磷酸鸟苷（GDP）之间相互转化来完成的，在体内保持动态平衡。这种平衡受到3种不同因子的调节，即GDP分离抑制因子（GDP dissociation inhibitor，GDI），能够使Rho GTPase（Rho GTP酶）与GDP分离，进而保持其低活性状态；GTP 酶活化蛋白（GTPase activating protein，GAP），能够激活Rho的酶活性，降低Rho蛋白活性；鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor，GEF），能够催化GDP转化为GTP。其中，起主要作用的是Rho GTPase鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEF）［1］。近些年来，RhoGEF已经成为功能蛋白研究的热点，不同领域的科学家相继报道了RhoGEF（Rho型鸟嘌呤核苷酸

交换因子）的结构和相关功能，证明RhoGEF在细胞信号转导、胚胎发育、免疫调节及疾病发生过程中发挥重要的作用。

1 RhoGEF蛋白的发现与结构

首个RhoGEF由Eva等于1988年从弥漫性B细胞淋巴瘤（Diffuse B lymphoma）中获得长度为45 kb的DNA序列，并命名为Dbl。Rho GTPase家族鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEF）主要包括两大类，即Dbl家族鸟嘌呤核苷酸交换因子与非Dbl鸟嘌呤核苷酸交换因子，其中研究较多的是Dbl家族的GEF［2］。目前，在人类当中至少已经鉴定出80种Dbl家族的GEF，果蝇当中有23种，线虫当中有18种，酵母当中有6种，其中包括Dbl、Vav、BCR（染色体易位形成的断裂点簇集区）、FGD1（Faciogenital dysplasia protein）、Tiam1（T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1）等［3］，并且不断发现新成员。所有Dbl家族成员都有一个共同的特点，即含有Vavl蛋白因含有Dbl同源结构域（Dblhomologydomain，DH）和与其串联的血小板白细胞C激酶底物同源结构域（Pleckstrin homology domain，PH）。DH结构域是一个含有200个氨基酸的全螺旋区域，它的三维结构是一个含有3个保守区域（CR1-CR3）的拉长的α螺旋束。CR2位于一侧，是形成寡聚物的位点。而CR1与CR3位于另一侧的中央，是与Rho GTPase结合的位点，称为“作用袋”［1］。DH结构域内部出现了许多疏水性基团的侧链，形成一个疏水的核心。在其结构域内部也出现了一些亲水性基团的侧链，通过这两种侧链的相互作用形成稳定结构，使得DH结构域在RhoGEF中发挥其催化活性的作用，激活Rho GTPase，使RhoGDP形态向RhoGTP形态转换［3］。DH结构域的催化作用和与其串联的PH结构域有着紧密的联系，PH结构域大约含有100个氨基酸，与DH结构域的C端串联，主要作用是调节DH结构域的功能，同时通过结合磷脂或蛋白进行亚细胞定位，将GEF结合到细胞骨架的特异位置并调节DH结构域活化Rho GTPase。DH-PH结构域的存在对于Dbl家族鸟嘌呤核苷酸交换因子发挥作用是必需的。

2 RhoGEF的功能

2.1 参与Rho GTPase活性的调节

Rho家族普遍存在于酵母细胞和大多数动物细胞中，参与许多细胞进程的调节。Rho GTPase非活性状态（与GDP结合）向活性状态（与GTP结合）之间转换这一过程主要由RhoGEF调控完成的。 RhoGEF能催化鸟嘌呤核苷酸换是因为它们与游离的Rho GTPase的亲合力大于Rho GTPase-GDP复合物的亲合力。 RhoGEF可以作用于Rho GTPase的switch1和switch2之间的催化位点，协助GDI将Mg2+和GDP剥离，同时稳定游离的Rho GTPase并使之结构发生变化。研究发现，几乎所有的RhoGEF都通过一个疏水性和一个酸性氨基酸作用于Rho GTPase，占据其核苷酸连接区的Mg2+和磷酸基结合位点。GDP被剥离后，RhoGEF与游离的Rho GTPase形成二聚体，由于胞浆中GTP的浓度远远大于GDP且Rho GTPase经过变构更利于与GTP结合，形成Rho GTPase-GTP复合物，Rho GTPase又发生变构，GEF解离，Rho GTPase处于活化状态，完成一个循环［2］。此外，RhoGEF还负责Rho GTPase的膜定位，如Dock180（downstream of crk with moleculer weight of 180 × 103of human）利用其DHR-1（Dock同源区域-1）结构域可以将Rho GTPase定位到需要的位置［4］。

2.2 参与胚胎发育及神经元的形成

近年来越来越多的研究表明，在生物体内Rho-GEF参与了许多器官的发育与分化。研究人员把斑马鱼的Obscurin A（遮蔽蛋白A）结构域中与RhoGEF相互作用的区域去除后，斑马鱼胚胎发育明显受阻，其心脏、骨骼肌与大脑出现发育迟缓与不完全［5］。在动物胚胎发育过程中，RhoGEF Pbl（Pebble）可以通过其PH结构域与磷脂酰肌醇相互作用并将磷脂酰肌醇定位在质膜上来调节中胚层的移动。Nakamura等［6］研究发现在RhoGEF Ect2（上皮细胞转化序列2）表达不足的情况下，果蝇胚胎发育过程中后肠出现了左右不对称现象并导致胚胎发育异常。其机制可能是Ect2影响了卵裂过程，而卵裂不正常可以导致胚胎发育的异常。在秀丽隐杆线虫的发育研究中也发现了RhoGEF类似的功能。Marcus-Gueret等［7］发现在秀丽线虫发育过程中，其排泄管的延伸是RhoGEF TRIO与RacGEF UNC-73共同调

节完成的。RhoGEF在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。

RhoGEF在神经元形成中的作用近年来也逐渐被认识。Meiri等［8］发现，在灵长类前额叶皮层中 RhoGEF Lfc［Lbc（lymphoid blast crisis）’s first cousin］亚细胞分布直接影响了神经元的激活，这种影响的机制很可能是Lfc的表达调节微管与肌动蛋白的耦合，Lfc的分布失衡会影响细胞骨架的形成，进而使神经细胞轴突和树突的伸展受到影响。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。突触重塑异常导致许多重要的神经疾病，但目前对突触重塑的分子和细胞机理的认识非常有限。近年来，有人研究发现RhoGEF ephexin1（神经细胞鸟嘌呤核苷酸交换因子1）可以通过调节神经递质AchR（乙酰胆碱受体）来调节突触重塑过程［9］。这一发现对搞清楚某些神经性疾病的发病机制具有重要意义。

2.3 参与机体的免疫调节

PMNs（中性粒细胞）是机体重要的炎症细胞，在机体天然免疫应答中发挥重要作用，趋化是其正常发挥作用的必要过程。Rho GTPase中的Rac及其GEF Dock2（downstream of crk with moleculer weight of 2×103of human）在PMNs趋化中起着重要的作用，Dock2先在PIP3（3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇）的作用下转移到质膜上并逐渐积累，在积累量达到一定程度后会与磷脂酸相互作用使其在质膜上更加稳定，进而促进Rac的定位及聚集。当Dock2表达受阻，PMNs的趋化会受到严重的影响。对Dock2突变小鼠的研究证明，Dock2在I型干扰素的分泌及免疫应答中起着决定性的作用［10］。在免疫应答中，抗原呈递细胞可以通过MHC（主要组织相容性复合体）识别T细胞，T细胞通过其表面受体TCR（T细胞抗原受体）识别抗原的同时也识别与其结合的MHC分子。RhoGEF Vav1 可以调节MHCII的转运及定位，进而激活CD4+T细胞，完成相应的免疫应答［11］。在果蝇中也有类似的发现，其中RhoGEF Zir（Ziziminrelated acts）与哺乳动物Dock-C同源，Zir在果蝇的细胞免疫应答中起着非常重要的作用，它可以直接激活Rac2和Cdc42（细胞分裂周期蛋白42）［12］，进而参与到细胞免疫中。RhoGEF在参与免疫调节中的功能具有保守性。

3 RhoGEF与疾病

3.1 RhoGEF在肿瘤发生中的作用

目前已知的RhoGEF绝大多数都属于原癌基因，其异常可以导致肿瘤的发生与迁移，慢性粒细胞白血病是其中较为明显的例子。作为RhoGEF的一员，BCR会与从9号染色体易位过来的ABL（艾贝尔逊白血病病毒）原癌基因形成融合基因，其融合表达产物p210与p190表现出高水平的PTK（蛋白酪氨酸激酶）活性。BCR-ABL激酶在细胞信号转导中发挥重要作用，它通过磷酸化活化一系列下游底物，促使成熟粒细胞无限增生，在骨髓内大量聚集，进而抑制骨髓的正常造血［13］，导致这种白血病的发生。

Tiam1是另外一个很常见的RhoGEF原癌基因。Tiam1可以通过Tiam1-Rac1介导的各种信号转导途径实现对细胞骨架结构的重组、细胞增殖与凋亡、细胞运动和迁移等生物学过程的调节。研究发现，Tiam1过表达与肿瘤的侵袭转移密切相关，其迁移机制可能是Tiam1的DH功能区具有鸟核苷酸转换的功能，PH功能区能介导蛋白复合物的形成，诱导细胞膜皱褶，从而诱导肿瘤细胞的侵袭与转移［14］，但尚需进一步的试验证明。

Asef（APC激活鸟嘌呤核苷酸交换因子），也是一个典型的RhoGEF原癌基因。它会与APC（大肠腺瘤样息肉基因）变异产生的蛋白结合，使细胞发生转化。APC-Asef复合体参与细胞迁移和神经元功能的调节，与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关。在大肠细胞中Asef活性增大，细胞间的黏合力就会减弱，息肉更容易生成［15］，其恶性结果便是癌变。同样，RhoGEF GCF2（GC结合因子2）可以通过调节RhoA减少细胞间的黏合，诱使结肠癌细胞转移、侵袭［16］。随着研究的深入，越来越多的新RhoGEF被发现与肿瘤有关，为阐明肿瘤发生的机理提供了另一条途径。

3.2 RhoGEF在神经性疾病发生中的作用

神经元轴突和树突末梢的生长及突触的形成与其内部的肌动蛋白细胞骨架在组织形态上的改变相关，刺激这种改变的信号主要通过Rho GTPase中

的Cdc42信号通路传入神经细胞。FGD1是Cdc42的GEF，FGD1突变导致突触的形成不完全，诱发精神迟滞症的发生［17］。FGD1的突变还可以引起多种发育疾病，如Aarskog-Scott氏症、注意力缺陷多动症（ADHD）等。目前至少有16种疾病中发现了FGD1的突变，发生突变的区域主要在其DH结构域［18］。肌萎缩侧索硬化症（ALS）也是一种运动神经元紊乱疾病，该疾病的发生是RhoGEF家族Alsin的DH结构域的丢失突变引起的［2］。RhoGEF α-Pix主要在小鼠海马体的神经纤维区域表达，在小鼠中敲除其编码基因Arhgef6，结果导致Rho GTPases失调，海马体中的神经连接改变及突触受损，正常发育受到了影响，最终导致X-连锁智力障碍的发生［19］。RhoGEF的功能缺失导致发育异常，进而诱发许多神经性疾病。

3.3 RhoGEF在病原微生物感染中的作用

RhoGEF除了与许多发育性疾病和肿瘤发生有关外，家族中许多成员还参与了病原微生物侵染宿主细胞的过程，其中与病毒浸染关系密切的是Vav与p115-RhoGEF。人类嗜T细胞病毒I型（HTLV-1）在侵染T细胞时，会通过改变Vav的磷酸化来调节侵染过程［5］。人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）在感染人体过程中释放的蛋白Nef会与Vav相互作用，增强Vav及下游效应器的活性，改变细胞骨架的形态，进而引起病毒血症［20］。HIV-1的包膜蛋白gp41可以使p115-RhoGEF失活，从而影响RhoA的功能，干扰T细胞与其他细胞之间的联系［2］。

某些细胞内寄生或兼性寄生的病原菌可以通过调节RhoGEF活性来促进其侵入宿主细胞，如沙门氏菌（Salmonella）可以分泌在结构及功能上与RhoGEF相似的SopE蛋白并将其转运至宿主细胞内，SopE可以调节Rho GTPases活性状态，诱导细胞骨架重排，增强宿主细胞对病原菌的呑饮能力，促进细菌进入宿主细胞［21］。RhoGEF在病原体感染过程中发挥着重要的作用。

4 展望

RhoGEF家族可以分为两大类，即Dbl家族和非Dbl家族。目前有关Dbl家族的报道较多，而有关非Dbl家族的相对少。在非Dbl家族中是否存在着另外一种具有共同特征的RhoGEF家族还有待进一步的发掘及确认；在Dbl家族的研究中仍然存在许多不清楚的问题，如DH结构域如何精确特异的识别不同的Rho GTPase、如何在多种不同的PH结构域中确定一个保守的区域及脂质如何通PH结构域来调节RhoGEF的活性等。目前人们对RhoGEF在疾病中的作用机制，尤其是对非Dbl家族的RhoGEF的了解还知之甚少。深入了解RhoGEF的活性调节与功能对于阐明RhoGEF相关疾病的发生机制十分重要，通过机制的研究将为临床治疗提供靶点，促进相关药物的研发。

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（责任编辑 狄艳红）

RhoGEF Family and the Role in Occurrence and Development of Diseases

Rho GTPases family plays a role of molecular switch in many cellular processes, including cytoskeletal dynamics, vesicle trafficking and gene transcription. Guanine nucleotide exchange factors（RhoGEFs）are the key regulator of activity for Rho GTPases. RhoGEFs can regulate signal transduction of Rho GTPases, development of tissues or organs and immune response. RhoGEFs are associated with cancer, development or neural system related diseases and pathogen infection, understanding of its function will help us to verify the mechanisms of some physiological and pathological process.

Rho GTPase Guanine nucleotide exchange factors（GEFs） Disease occurrence

Liu Mingtao1Yang Jun2Wang Zhigang1
（1. College of Life Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021；2. Hohhot Institute of Enviromental Sciences，Hohhot 010030）

2013-08-13

国家自然基金项目（31160469），内蒙古自然基金项目（2011MS0521）

刘明涛，男，硕士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：uulmt999@sina.com

王志钢，男，教授，研究方向：哺乳动物生殖生物学与生物技术；E-mail：lswzg@imu.edu.cn