蛋白质组学的应用研究进展

蛋白质组学的应用研究进展

尹稳1伏旭2李平1
（1.兰州大学第二医院，兰州 730030；2.兰州大学第二医院急救中心，兰州 730030）

蛋白质组学（Proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科。虽然基因决定蛋白质的水平，但是基因表达的水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平，蛋白质组学分析是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。蛋白质组学相关技术的发展极大地推动了蛋白质组学的研究进展，使其在各研究领域得到了广泛的应用。对蛋白质组学相关技术及其在各领域的应用进行了综述，最后对蛋白质组学的发展趋势和应用前景作出展望。

蛋白质组学 双向凝胶电泳 质谱 生物信息学 应用现状

随着基因组计划的完成，生命科学研究开始进入以基因组学、蛋白质组学、营养组学、代谢组学等“组学”为研究标志的后基因组时代。蛋白质组（proteome）一词最早是由澳大利亚科学家Wilkins和Williams于1994年提出［1］，1995年7月最早见诸于Electrophoresis杂志［2］，意指一个细胞或组织中由基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织、体液中的所有蛋白质组成、功能及其蛋白之间的相互作用的学科。

虽然基因决定蛋白质的水平，mRNA只包含了转录水平的调控，其表达水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平［3］，且转录水平的分析不能反应翻译后对蛋白质的功能和活性起至关重要作用的蛋白修饰过程［4］，如酰基化、泛素化、磷酸化或糖基化等。而蛋白质组学除了能够提供定量的数据以外，还能提供包括蛋白定位和修饰的定性信息。只有通过对生命过程中蛋白质功能和蛋白质之间的相互作用以及特殊条件下的变化机制进行研究，才能对生命的复杂活动具有深入而又全面的认识。近年来，蛋白质组学技术取得了长足的发展，随着新技术的不断涌现，其应用范围也不断扩大。本文对蛋白质组学相关技术及其在各研究领域的应用进行了简要的归纳和评述，并对蛋白质组学的发展趋势和应用前景

作出展望。

1 蛋白质组学的分类

根据研究目的和手段的不同，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。其研究技术为经典的蛋白质组学技术即双向凝胶电泳和图像分析。在蛋白质组水平上研究蛋白质表达水平的变化等，是应用最为广泛的蛋白质组学的研究模式。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目标的蛋白质组学称为“细胞图谱”或结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞产生的特定作用［5］。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及其蛋白质之间的相互作用为研究目的，对选定的蛋白质组进行研究和描述，能够提供有关蛋白的糖基化、磷酸化，蛋白信号转导通路，疾病机制或蛋白-药物之间的相互作用的重要信息。

2 蛋白质组学的主要研究技术

蛋白质组学研究的进展是由技术推动的，同时也受到技术的限制。蛋白质组学研究的技术水平很大程度上决定了研究成功的可能性。蛋白质组学研究的核心就是能够系统地鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质并确定每一个蛋白质的突出性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、差异凝胶电泳、质谱分析等。其中双向电泳技术从开发到应用已经30多年［6］，是蛋白质组学研究的核心技术之一；差异凝胶电泳技术［7］能够进行大样本统计分析，且灵敏度高；质谱技术包括生物质谱、飞行时间质谱、电喷雾质谱等，通常与双向电泳等蛋白分离技术相联用，具有灵敏、准确、自动化程度高等特点，是蛋白鉴定的核心技术。除了上述几种主要的技术外，近年来蛋白质芯片技术、酵母双杂交系统和生物信息学分析也应用于蛋白质组学。由于其操作简便，样品用量少并能对多个样品进行平行检测，蛋白质芯片技术与其他常规方法相比具有明显优势［8］；酵母双杂交系统主要针对活细胞内蛋白质的研究，近年来已经发展到检测小分子-蛋白质，DNA-蛋白质及RNA-蛋白质之间的相互作用上；物信息学是蛋白质组学研究的核心技术之一，由于通过双向电泳，质谱或蛋白质芯片所获得的数据通常都是高通量且比较复杂，只有通过生物信息学分析才能对蛋白质的种类、结构和功能进行分析确定。

3 蛋白质组学的应用现状

3.1 蛋白质组学在疾病研究中的应用

蛋白质组学在疾病研究中的应用主要是发现新的疾病标志物，鉴定疾病相关蛋白质作为早期临床诊断的工具，以及探索疾病的发病机制和治疗途径。人类的许多疾病已经从蛋白质组学方向展开研究，并取得了一定的进展。Lei等［9］通过2-DE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱等蛋白质组学相关技术对膀胱癌患者的尿蛋白进行分离鉴定，获得14个差异表达的蛋白质，这些差异表达的蛋白可能是诊断和检测膀胱癌的潜在尿标志物。McKinney等［10］应用亚细胞蛋白质组学方法对原发性和转移性的4个胰腺癌细胞差异表达的蛋白质进行鉴定，有540个蛋白质是原发性癌细胞特异性的，487个具有转移部位癌细胞特异性。通过统计学分析鉴定出134个显著性差异表达的蛋白质，可用于进一步研究以确定其在肿瘤发生和转移过程中的作用。Tetaz等［11］应用尿蛋白质组学方法对肾移植后3个月获得的29个尿样进行分析，鉴定出18个预测慢性移植肾功能障碍（CAD）的生物标志物，其中8.860 kD的蛋白标志物在预测CAD方面具有最高的诊断性能。这些生物标记物在肾移植后3个月即可检测出，最长可以鉴定出在移植后4年可能发生CAD的病人。Brea等［12］应用双向电泳联合质谱技术，对12例心源性脑栓塞症患者和12例粥样硬化血栓性梗死患者的血清蛋白进行差异比较，发现触珠蛋白相关蛋白和淀粉样蛋白A等蛋白质在粥样硬化血栓性梗死患者中的血清水平显著升高。Wen等［13］对人类美洲锥虫病患者的血清蛋白质组学进行了研究，以探索其潜在的病理生理学机制。通过MALDI-TOF MS/MS对高丰度和低丰度锥虫病患者的血清蛋白进行分析，分别获得80和14个差异表达的蛋白质。检测出的心脏相关蛋白和黏着斑蛋白与血纤维蛋白溶酶原的表达水平的增加为临床人类美洲锥虫病心肌损伤和发展的研究提供了一组比较全面的生物标志物。

Kikuchi等［14］首次应用标准的散弹蛋白质组学分析方法对非小细胞肺癌的两种主要亚型和正常肺组织进行了深入蛋白质组学分析，鉴定出许多新的可作为潜在诊断和治疗的分子标志物的差异表达蛋白。

3.2 蛋白质组学在遗传病学研究中的应用

蛋白质组学在遗传病学中的应用主要是为了探索遗传病的发病机制，寻找用于遗传病的早期诊断的生物标记和特异性的药物靶点等。常见的遗传病主要包括：单基因遗传病，多基因遗传病，线粒体遗传病及体细胞遗传病等。Polprasert等［15］应用蛋白质组学方法对遗传性球形红细胞增多症（HS，单基因遗传病）的红细胞膜蛋白变化进行研究，分离鉴定出56个差异表达的蛋白质，通过蛋白质网络分析出包括细胞死亡，细胞循环及遗传性和血液性紊乱3个HS相关的重要网络，为进一步研究和了解HS相关的发病机制提供了参考。Yang等［16］对阿尔茨海默病（多基因遗传病）模型大鼠的脑突触体进行了蛋白质组学分析，得到14种差异表达的蛋白质，通过MALDI-TOF MS鉴定出α-2-珠蛋白链和与细胞凋亡和信号转导有关的肽基脯氨酸反式异构酶A与丝切蛋白-1三种蛋白，这些差异表达的蛋白有助于对阿尔茨海默病发病机制的了解。Rabilloud等［17］研究了线粒体tRNA基因的点突变对线粒体蛋白结构的影响，通过双向凝胶电泳和质谱技术对健康人和和病态下的线粒体蛋白的表达进行研究发现，核编码的细胞色素C氧化酶的亚单位蛋白的表达水平明显降低，表明线粒体tRNA基因的点突变会影响核编码蛋白的稳态水平。

3.3 蛋白质组学在药物研究中的应用

随着蛋白质组学的快速发展，相关的研究技术在药物研究领域的应用也越来越多，为快速，特异，高通量的药物研究提供了有力的技术支持。Huang等［18］应用蛋白质组学方法对奥利司他抗肿瘤药物处理过的人卵巢癌细胞SKOV3的蛋白质表达变化进行了研究，鉴定出71个差异表达的蛋白质，其中与肿瘤发生有关的关键酶PKM1/2在经过奥利司他处理后表达显著下调，证明奥利司他是一种潜在的卵巢癌抑制剂，并可以作为新的抗肿瘤辅助药物。Lin等［19］应用蛋白质组学技术对阿霉素处理的人子宫癌细胞的蛋白表达变化进行研究发现，有37种差异表达的蛋白质，为阿霉素抗性的子宫癌细胞的治疗提供了诊断和治疗标志物。Li等［20］利用双向电泳联合质谱技术对蓝藻细菌衍生的微囊藻素-亮氨酸-精氨酸（MCLR）诱导的神经毒性相关的蛋白进行鉴定发现，MCLR处理的海马区与神经变性疾病、氧化应激及能量代谢相关蛋白的表达发生变化，且MCLR能够诱导抑制蛋白磷酸化和神经微管相关蛋白tau的异常高度磷酸化，证明MCLR可以诱导神经中毒效应，导致记忆损伤及神经退行性病变等。Bauer等［21］对紫杉醇类药物治疗乳腺癌复发的患者应用蛋白质组学方法进行分析，在其组织中发现α-防卫素过度表达，大量研究表明α-防卫素可以作为预测紫杉醇类药物对乳腺癌治疗作用的生物学标记物。O'Connell［22］等应用液相色谱-质谱联用技术对DU145，22RV1和 PC-3三种前列腺癌细胞系与相应的多西他赛抗性的子代细胞系间差异表达的蛋白进行鉴定，鉴定出的差异表达的蛋白质有助于进一步了解细胞抗性的潜在生化机制，对提高临床疗效有着至关重要的作用。

3.4 蛋白质组学在植物学研究中的应用

利用蛋白质组学在植物领域进行研究的报道已经很多，如对农作物的不同组织、器官和亚细胞水平的蛋白组的研究，植物突变体差异表达蛋白的鉴定，环境胁迫条件下蛋白表达水平变化的研究等。Khatoon等［23］利用蛋白质组学方法对大豆幼苗在低氧和水胁迫条件下的应答机制进行了研究分析，对根部的蛋白进行分离鉴定出27个差异表达的蛋白斑点，其中与代谢和能量相关的蛋白表达增加，而存储相关的蛋白表达水平降低。与低氧胁迫条件相比，水胁迫条件下存储蛋白和疾病/防御蛋白的表达下调对大豆幼苗的生长产生更大的抑制作用。Aghaei等［24］通过双向凝胶电泳技术对盐胁迫下大豆蛋白质表达谱进行了研究分析，检测到7个重复性较好的差异表达的蛋白，研究表明盐度能改变一些胚轴和根部特定蛋白的表达，这些差异表达的蛋白可能与耐盐性相关。Ngara等［25］利用双向凝胶电泳电泳联合质谱技术对盐胁迫条件下高粱幼苗叶子的蛋白表达进行研究，在盐胁迫下有118个显著变化的蛋

白，鉴定出的差异表达的蛋白可以分为6大类，包括已知的和推定的胁迫应答蛋白。Anne-Catherine等［26］应用2D-DIGE技术对香蕉的耐旱性进行研究，从叶子蛋白质组中鉴定出24种差异表达的蛋白质。通过蛋白质组学分析表明在受胁迫植物中存在一种新的平衡，其中呼吸，活性氧的代谢以及一些脱氢酶的体内平衡发挥着一个比较重要的作用。Randall小组［27］运用蛋白质组学方法对八倍体草莓的低温应答机制进行了研究，通过对“Jonsok” 和“Frida”两种品系经过不同时间的冷处理后进行双向凝胶电泳和定量蛋白质组学分析，鉴定出135种特异表达的蛋白质，并鉴定出许多耐寒性相关的生物标记分子。Zhao等［28］应用质谱和分子生物学技术对乳腺癌患者的糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白进行了蛋白质组学鉴定，发现糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白表达水平的增加有助于恶性乳腺癌上皮细胞的去分化，可作为乳腺癌诊断和潜在治疗靶点。

3.5 蛋白质组学在食品科学研究中的应用

蛋白质组学技术的迅速发展为食品科学研究提供了新的研究思路和技术，在食品中过敏的检测、食品成分的鉴定等食品科学研究领域已经具有广泛的应用。Coscia等［29］应用蛋白质组学研究技术对牛奶的蛋白质和人乳的微量成分进行检测，收集了62个正常分娩的和11个早产初乳样品，通过蛋白质组学相关研究发现在人初乳中存在完整的牛α-S1-酪蛋白，α-1-酪蛋白被认为是在人乳中分泌的牛乳过敏原，可能是纯母乳喂养婴儿对牛奶过敏的原因之一。Hong等［30］通过液相色谱联合质谱技术对古代食物残渣进行鉴定发现，食物残渣中存在牛奶成分，此研究为古代的残留物的分析及其他考古领域提供了一种新的研究方法。Pedreschi等［31］将鸟枪法蛋白质组学方法应用于烘烤饼干中花生过敏原的检测，通过检测花生过敏原Ara h的3/4水解肽段来确定花生的存在，建立的检测方法在微量级水平即可检测出花生过敏原的存在。李明云等［32］通过对不同裂解液配方、等电聚焦程序和上样量等条件的优化，建立了大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳的相关技术体系，提高了大黄鱼肝脏蛋白双向电泳图谱的分辨率，为大黄鱼肝脏蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。Andrade等［33］应用比较蛋白质组学方法对预成熟的和成熟期的芒果在成熟过程中差异表达的蛋白进行鉴定，通过2-D凝胶电泳和液相色谱-质谱技术共鉴定出47种差异表达的蛋白质。在这些蛋白质中，与碳固定和激素的生物合成相关的蛋白在成熟过程中减少，而与分解代谢和压力应答相关的蛋白逐渐积累，为芒果成熟过程中的生物学变化提供了一个概括性的研究。

3.6 蛋白质组学在微生物学研究中的应用

蛋白质组学研究技术已应用到生命科学的各种领域，在微生物学研究中，可用于病原微生物致病机制、耐药机理、病毒感染的研究以及新型疫苗的研发等。Fernandez等［34］对加入羧甲基纤维素的培养基培养的葡萄孢菌蛋白质通过双向凝胶电泳分离，选择267个蛋白斑点用于MALDI-TOF MS分析鉴定发现，许多蛋白质在其致病过程中具有重要的作用。Fang等［35］利用2-DE和MALDI-TOF MS对草莓炭疽菌感染的草莓幼苗叶子的蛋白质组进行研究，鉴定出49个显著差异表达的蛋白质，在感染后期，开尔文循环和糖酵解途径相关蛋白的表达受到抑制，此研究增加了对病原抗性机制的了解。Ansong等［36］利用液相色谱-质谱联用技术对对数期、静止期和低pH/低Mn条件下沙门氏菌（S.typhiTy2）的蛋白质组进行鉴定，共鉴定2 066个蛋白质。研究发现S.typhiTy2存在一组高表达蛋白，推测这些蛋白与S.typhi的病原性和宿主专一性有关。Zhang等［37］应用比较蛋白质组学方法对外膜蛋白P5缺陷突变菌株副猪嗜血杆菌SC096的蛋白质组进行研究，得到24种差异表达的蛋白质，主要包括碳水化合物、脂肪、氨基酸代谢相关蛋白，转录翻译因子及伴侣蛋白等。在牛乳腺炎的宿主和病原菌的应答机制的研究，蛋白质组学分析技术被用于病原菌毒性因子、抗原蛋白的鉴定及用于分离牛乳腺炎致病菌株的特异性蛋白，为临床乳腺感染的病原菌应答机制的研究提供了较多的理论依据，通过兽类病原菌蛋白质组学分析已经鉴定出疫苗研发的潜在作用靶点，并阐明了在宿主环境下细菌从入侵到存活的前在作用机制［38，39］。

3.7 蛋白质组学在生物膜研究中的应用

生物膜在活细胞及其外界环境之间形成了一个

重要屏障，还用于划分真核生物细胞内的细胞器。大约有1/4-1/3的细菌的基因用于编码细菌的内膜或外膜的蛋白质。这些蛋白执行一些基本的生理功能，如代谢物、有毒物质或抗生素的排出，维持细胞内离子的动态平衡及能量的产生和转换等。对于真核生物的细胞器膜，其高度专业化的功能大多是由膜上的相应蛋白质执行完成的。Liu等［40］利用比较膜蛋白质组学方法对H5N1病毒分别感染6、12和24 h的人肺腺癌细胞A549进行蛋白分析鉴定，得到24个差异表达的蛋白质，其中57%为膜蛋白或膜相关蛋白，通过siRNA技术鉴定出与病毒增殖相关的几种蛋白，对病毒感染过程中宿主膜蛋白作用的了解提供了新的认识。Vishvanath等［41］应用比较蛋白质组学方法对碳青酶烯抗性菌株——鲍氏不动杆菌的内膜部分进行研究，鉴定出19个过表达的和4个表达下调的蛋白质，在表达上调的蛋白质中包括β-内酰胺酶、代谢酶和核糖体酶蛋白等，在鲍氏不动杆菌产生耐药性的过程中，低水平的表面抗原有助于逃避宿主的防御机制。Wang等［42］应用2-D差异凝胶电泳技术对非洲爪蟾蜍的外胚层和中胚层组织的膜组分中的蛋白质含量进行了比较分析，鉴定出一些在一个或其他组织中含量丰富的蛋白质，包括细胞骨架和细胞信号转导的调节者，有助于阐明胚胎中的各种不同组织的特定功能。Jia等［43］对乙醇诱导的肝硬化模型大鼠进行了动态的质膜蛋白质组学分析，通过2-D凝胶电泳和串联质谱鉴定出16种差异表达的蛋白质。这些差异表达的蛋白质可能是酒精性肝硬化治疗的新药物靶点。

4 展望

蛋白质组学是一门在蛋白质水平上认识生命机理的学科，其学术理念和相关技术方法已被广泛应用于生命科学的各个领域，涉及多种重要的生物学现象，并已成为人类重大疾病诊断、治疗和寻找药物靶点的有效方法之一。虽然蛋白质组学还存在一些问题，如蛋白质组学的相关技术在自动化操作、灵敏度检测方面存在某些缺陷；由于仪器价格昂贵使得相关技术的推广受到限制；蛋白质组学方法标准不统一，各实验室的结果不能很好地重复等。但是，作为一门新兴学科，其广阔的应用前景却是不容置疑的。由于存在蛋白质翻译后的修饰和定位，蛋白质组学分析是对翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。

蛋白质组学的广泛应用为其发展提供了更多的需求和发展方向，在以后的研究中，蛋白质组学的研究将会出现多技术、多学科的交叉，这种交叉是新技术、新方法的活水之源，蛋白质组学技术与基因组学、生物信息学等领域的交叉，呈现出的系统生物学研究模式，将会成为生命科学研究的新前沿，如：蛋白质组学在代表了21世纪毒理学发展方向的系统毒理学方向的研究。此外，蛋白质组学在艾滋病、神经退行性疾病、严重帕金森病和老年性痴呆等人类重大疾病的攻克方面也具有十分诱人的前景。可以预见的是，将来可以开发出综合运用蛋白质组学、生物信息学和基因组学等多学科相关技术的蛋白质组芯片，能够快速、灵敏、准确地分析鉴定人类疾病的相关信息，为疾病的临床诊断和治疗提供一定的科学理论依据。相信在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域和应用前景将会更加广泛。

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（责任编辑 狄艳红）

Application Research Progress of Proteomics

Yin Wen1Fu Xu2Li Ping1
（1. Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030；2. Department of Emergency，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030）

Proteomics is an emerging discipline for studying proteins composition and function in a type of cell, tissue or body fluids in a large-scale, high-throughput and systematic level. While genes determine the level of protein, but the level of gene expression can not represent the intracellular reactive protein levels. Proteomic analysis is a complement to the study of translation and modification and also an indispensable tool for a comprehensive understanding of genome expression. The development of proteomic technologies has greatly promoted the progress of proteomic research, and it has been widely used in various research fields.This paper revieweded the proteomic technologies and the applications in various fields are also briefly reviewed. Finally, some future issues are presented.

Proteomics Two-dimensional gel electrophoresis Mass spectrometry Bio-informactics Application status

2013-09-05

甘肃省科技计划基金资助项目（0708NKCA129），兰州大学第二医院医学研究基金项目（YJ2010-08）

尹稳，女，硕士，研究方向：蛋白质组学；E-mail：yinwen0508@163.com

伏旭，男，硕士，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：fuxu0910@163.com