马铃薯晚疫病防治的转基因策略

马铃薯晚疫病防治的转基因策略

肖欢欢 辛翠花 丁艳 朱佳莉 郭江波
（内蒙古科技大学数理与生物工程学院，包头 014010）

晚疫病是由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的病害，是限制马铃薯产业发展最严重的病害之一。采用传统育种和化学农药等方法防治马铃薯晚疫病虽然早有研究，但至今收效甚微。基因工程技术的兴起为防治马铃薯晚疫病提供了新的契机，并已取得了一定成效。但单基因抗性容易丧失、水平抗性应用难度大，要提高抗病基因的持久性，同时释放多个抗病基因，人为提高田间抗病基因的多态性是目前可选途径之一。对各种防治方法进行了综述，通过转基因技术创建抗病基因近等混合系是持久防治马铃薯晚疫病的首选可行方法，概述了其发展前景。

马铃薯 晚疫病 抗病基因近等混合系

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是世界第三大粮食作物，栽培面积仅次于水稻和小麦。马铃薯粮菜兼用，生育期短，单位面积产量高，而且营养丰富，含有大量淀粉，优质蛋白，以及多种维生素和矿物质。现在全球种植马铃薯的国家有148个，总产量达3×108t。马铃薯在食物安全系统中将发挥越来越重要的作用，但耕地面积的减少，对马铃薯的生产是一个巨大的挑战，同时也是马铃薯发展的巨大机遇。国际马铃薯中心（CIP）的研究表明，在世界范围内对马铃薯的需求到2020年将有望增长20%［1］。但马铃薯晚疫病严重限制了其产量和发展，本文就马铃薯晚疫病的各种防治方法进行综述，特别对通过转基因技术创建抗病基因近等混合系防治马铃薯晚疫病的方法进行概述。

1 马铃薯晚疫病的危害

晚疫病是由致病疫霉菌（P.infestans）引起的，是引起马铃薯产量损失最严重的病害之一。马铃薯晚疫病大发生主要与病原菌基数、品种抗性、气候因素、栽培模式等密切相关［2］。1847年由于晚疫病传播引起的饥荒，使100多万爱尔兰人死亡，200多万逃亡海外，史称爱尔兰大饥荒（The Great Irish

Famine）［3］。1996年，据国际马铃薯中心（CIP）估计，由于晚疫病的危害使马铃薯大量减产，在全球造成170亿美元的损失。在我国，马铃薯生产也一直受到晚疫病的危害，特别在50年代到60年代初，华北、东北和西北曾几次发生晚疫病大流行，使马铃薯生产损失过半［4］。因此，防治马铃薯晚疫病已成为当今世界马铃薯生产和育种工作中的重中之重。

2 晚疫病的防治

晚疫病的发生易受气候条件、种薯品种、田间管理等因素的影响［5］。针对其发病特点和生产方式，现在主要采用的防治技术有农业技术、化学农药和培育抗病品种等。

加强田间管理、采用不同的播种期及种薯处理等农业技术虽然在晚疫病的防治中确实有一定的作用，减轻了晚疫病的危害，但效果并不理想［6］。这些措施只能是预防，“治标不治本”，不能从根本上防治马铃薯晚疫病，且工作量大，有时徒作无用功。化学防治仍是目前控制晚疫病流行的主要措施。而致病疫霉菌生理小种进化速度极快，单纯靠除草剂、杀虫剂、铜制剂等化学药剂来防治晚疫病很快就会使病菌产生抗药性［5］，从而使病害再度流行，且会有药害残留。将不同的化学药剂组合在一起防治晚疫病，确实取得了一定成效，但由于不同的地区间存在着致病力和抗药性不同的生理小种，会大大增加选择药剂组合的难度和广度，一旦病菌产生了抗药性，前期工作就会前功尽弃。此外，化学农药易污染环境，成本也较贵，故其应用推广受到了限制。

因此，培育抗病品种就成了防治马铃薯晚疫病切实有效的方法。随着20世纪抗病育种技术的发展，马铃薯抗晚疫病的遗传研究取得了突破性进展，育种工作者从野生马铃薯品种（Solanum demissum）中鉴定分离出了11个主效抗晚疫病基因（R1、R2、R3……R11），并利用基因渗入等方式将大多数抗性基因整合进栽培品种中［7］。但晚疫病原菌具有混合的交配方式和高的基因流，属于进化潜力最高、风险最大、最易克服单一抗病性的病原菌之一［8］。马铃薯常规育种周期长，且这些R基因都是由单基因控制的小种专一抗性，因而经多年努力培育的抗病品种很容易被病原菌克服，抗病持久性弱。育种家试图从其他野生种中寻找新的抗病基因或者利用水平抗性基因来实现持久抗性的目标。但这种途径也困难重重。有性杂交障碍和连锁累赘使得从其他野生种中寻找抗病基因导入栽培品种并育成商业品种非常困难［9］。

20世纪后期转基因技术的兴起为马铃薯晚疫病的防治工作提供了新的契机，从抗晚疫病的野生品种中分离出各种抗病基因，并将其转入到目前栽培品种中的策略，成为目前获得持久性抗晚疫病的最快捷的手段。

3 马铃薯抗晚疫病转基因研究

近年来马铃薯抗晚疫病基因克隆取得了很大的进展，已经有来源于野生种S.demissum的R1和R3a及来源于S.bulbocastanum的RB和Rpi-blb2被克隆［10-13］，一些新的抗晚疫病基因被定位［14，15］、马铃薯基因组的测序［16］和抗病基因数据库建立［17］为抗晚疫病的转基因研究奠定了基础。

马铃薯抗晚疫病的转基因研究近年来也取得了一些效果。如Liu等［18］、Zhu等［19］和李汝刚等［20］分别报道了烟草Osmotin蛋白转基因马铃薯植株可以推迟晚疫病病斑出现时间，降低P.infestans的浸染频率，赋予叶片抗晚疫病的能力；李汝刚等［21］报道，Harpin基因的组成型表达和病源诱导表达均赋予转基因马铃薯植株抗晚疫病的能力；金红等［22］将从非洲甜菊中分离出来的类甜蛋白基因（tlp）及其紧密连锁的抗除草剂bar基因以农杆菌介导法导入马铃薯中，经晚疫病菌游离孢子接种离体抗性分析，转基因株系表现出对晚疫病的明显抑制作用和症状发生的延迟作用；Wu等［23］报道葡萄糖氧化酶（go）基因在转基因马铃薯中表达，降低了晚疫病菌对马铃薯的浸染速度；崔艳红等［24］利用VIGS技术研究表明SGT1和HSP90是参与RB和R3a抗病信号传导途径过程中的关键基因，该技术体系的建立，为发现新晚疫病抗病相关基因的功能验证提供了一个高效的技术平台；辛翠花等［25］通过农杆菌介导法将马铃薯的抗晚疫病基因R3a和R1分别导入马铃薯品种Desiree中，大多数转R3a和R1基因的马铃薯对对应菌株能够产生抗性；黄先群等［26］将甜

椒中分离出来的一种过敏反应促进蛋白hrap基因导入马铃薯品种“Burbank”中获得了抗晚疫病植株。

这些方法获得的抗性苗在一定程度上对晚疫病确实有一定的防治效果，但抗性不能持久，很容易被病原菌克服，从而使病害再度流行。在单基因抗性容易丧失、水平抗性应用难度大的前提下，提高田间抗病基因的多态性是马铃薯抗晚疫病的可行策略之一。提高田间寄主抗性空间多样性一般采用混合品种或近等混合系来实现［27］。但混合品种不仅抗性基因不同，而且可能熟性及薯块的其他商品性状也不同，混合品种法的推广受到了限制。因而创建抗病基因近等混合系将是持久防治马铃薯晚疫病的有效新策略。由于马铃薯是基因组高度杂合的同源四倍体作物，有严重的自交衰退现象，无法通过回交的方法育成近等混合系。因此，转基因技术将是创建抗病基因近等混合系的必由之路。

4 田间创建抗病基因近等混合系的基础

为进一步提高田间抗病基因的多态性以确保近等混合系在防治马铃薯晚疫病上成功应用，还需克隆更多的抗病基因。

Huang等［28］通过连锁不平衡发现了一个等位多态性较高的抗晚疫病基因位点，从野生种S. demissum导入的11个主效基因中有8个（R3，R5-R11）来自于该位点。因此，把它命名为马铃薯抗晚疫病主效位点（Major late blight resistance complex，MLB）。马铃薯MLB和番茄的抗枯萎病位点I2是同源的，都位于第11号染色体长臂的末端，且都是复合抗病基因位点，因此R3、R5-R11被称为MLB的单倍型（Haplotypes），而非经典意义上的等位基因（Alleles）。通过比较基因组学分析，发现MLB的R3单倍型有3个抗病基因簇，其中2个基因簇中有功能性的抗病基因，分别是R3a和R3b［29］。在这3个基因簇中发现的所有抗病基因类似物（40-60个）都是番茄I2基因的同源基因，并运用比较基因组学的方法克隆了R3a基因。在DNA和蛋白质水平上，I2和R3a分别有88%和83%的同一性，都属于CCNBS-LRR（coiled-coil nucleotide-binding site leucinerich repeat，卷曲螺旋-核苷酸结合位点- 富含亮氨酸重复结构域）类抗病基因。通过比较基因组学的方法来快速挖掘MLB，将为通过基因工程改良的方法构建抗病基因近等混合系，实现马铃薯田间抗晚疫病基因多态性提供原材料，从而达到马铃薯晚疫病的持久抗性。

5 展望

转基因技术在育种中的应用为马铃薯抗晚疫病育种创造了许多优良的抗病材料，但转基因技术生物安全性问题也是一个不容忽视的问题。如果在获得转基因材料的同时能够考虑到转基因产品对生态环境、食物及人类健康的影响，通过各种途径获得一些生物安全的转基因产品，并结合传统常规育种，建立一个持久的综合防治体系，真正服务于生产，为我国及世界马铃薯晚疫病的有效防治贡献出一份微薄力量。

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（责任编辑 狄艳红）

The Strategy to Control Potato Late Blight by Transgenic Technology

Xiao Huanhuan Xin Cuihua Ding Yan Zhu Jiali Guo Jiangbo
（College of Mathematics, Physics and Biological engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010）

Potato late blight is caused by Phytophthora infestans, which is one of the most serious threats to potato production. In previous research, it proved that it was difficult to control potato late blight by conventional breeding and chemical pesticides. There will be a new opportunity to control potato late blight due to the rise of gene engineering technology, and some success has been achieved. In order to improve the durability of resistance genes, one of the promising solutions for late blight control is to release several R genes simultaneously and artificially create a resistance polymorphism in the field, such as R gene polyculture. Through the comparison of various control methods, the strategy of R gene polyculture by transgenic technology is the first feasible method for controlling potato late blight, and the feasibility and prospects of create R gene polyculture were summarized in the article.

Potato Llate blight R gene polyculture

2013-09-25

国家自然科学基金项目（31260344），内蒙古自然科学基金项目（2011BS0506，2012MS0301），内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZZ11139），内蒙古科技大学李保卫大学生科技创新基金，内蒙古自治区教育厅“青年科技英才支持计划”

肖欢欢，男，硕士研究生，研究方向：植物遗传育种；E-mail：xiaohuan7867@126.com

郭江波，男，副教授，硕士生导师，研究方向：重金属环境污染物的植物修复分子机制；E-mail：primersyn@sina.com