遗传性非息肉病性结直肠癌的分子病理研究

聂 辰 李月廷▲ 赵保健 高 磊 闫 瑾 王俊懿

1.北京市中西医结合医院外科，北京 100039；2.北京德博全基因检测技术研究所，北京 100097；3.北京京蒙高科干细胞技术有限公司，北京 100085

遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC）是由于错配修复基因（mismatch repair gene，MMR）发生种系突变所导致的一种综合征。 Henry Lynch 最早描述了遗传性癌症综合征的临床特征[1]，故而HNPCC 又称为Lynch 综合征。HNPCC 的特征为结肠癌和其他肿瘤（如子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、小肠癌、肝胆系统肿瘤、上泌尿道肿瘤、脑部肿瘤和皮肤癌等）发病风险较高。 自1990 年起，HNPCC 国际合作组织及许多国家发布了多个HNPCC 家族的临床筛选标准[2-5]，我国也于2004 年发布了中国人遗传性大肠癌的筛检标准[6]。 多年来的临床实践和研究表明，临床诊断标准难以兼顾敏感性和特异性，将漏诊错诊大量病例[7]。因此我国在发布家系筛选标准的同时，还发布了分子病理的筛检策略，以弥补临床筛检策略的不足，包括MLH1 和MSH2 的免疫组化检测、MSI 检测和基因测序等[6]。

目前国内外公认MMR 基因外显子测序为诊断HNPCC 的金标准，但由于成本高、耗时长、技术难度高，不利于其推广应用。 有研究报道免疫组化检测MMR 基因突变的敏感性（77%～97%）及特异性（89%～100%）均较高[8]，能够直接反映出MMR 蛋白表达情况，且在全国各大医院均可开展，因此通过免疫组化筛查HNPCC 患者是一种行之有效的方案[9]。 本课题通过对北京地区94 例结直肠癌患者的肿瘤组织进行免疫组织化学染色，观察MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2四个MMR 基因的蛋白表达情况，研究北京地区住院人群HNPCC 的分子病理特征，评估北京地区住院人群HNPCC 的发病情况。

1 材料与方法

1.1 材料来源

94 例结直肠癌组织标本均采集自2012 年3～9 月于北京市中西医结合医院及解放军总医院住院接受手术治疗并经病理确诊为结直肠癌的患者。

1.2 免疫组化

1.2.1 试剂与仪器 MLH1 和MSH2 一抗购自Novocastra 公司，MSH6 和PMS2 一抗购自Epitomics 公司。光学显微镜购自奥林巴斯公司，型号为CX31。

1.2.2 实验方法 采用免疫组织化学的方法检测肿瘤组织内MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 蛋白的表达。 操作步骤如下：将肿瘤组织蜡块连续切片（厚度约4 μm），放入70℃烤箱烤片1 h。 梯度脱蜡：二甲苯脱蜡3 次各10 min；无水乙醇脱蜡3 次各5 min；95%乙醇脱蜡2 次各2 min；80%乙醇脱蜡2 min。 自来水、蒸馏水冲洗各20 s。 放入3%过氧化氢水溶液10 min。 自来水、蒸馏水冲洗各20 s，放入PBS 缓冲液中。 组织修复采用高温高压法：待高压锅内修复液沸腾后，放入切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2 min。修复液为pH 8.0 的EDTA 缓冲液。切片取出后放入PBS 缓冲液中充分洗涤3 次，每次3 min。取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，放入4℃冰箱内过夜。切片放入PBS 缓冲液中清洗3 次，每次3 min，充分洗涤。 滴加二抗，室温孵育20 min。 切片放入PBS缓冲液内洗涤3 次，每次3 min，充分洗涤。 进行DAB显色。苏木精复染细胞核。分化、返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 结果判定标准

参照Friedrichs 等[10]的免疫组化评判标准，采用半定量积分法，分别观察染色强度和阳性细胞所占百分数。 在40 倍镜下连续观察10 个视野，先按染色强度计分（染色深浅需与背景着色相对比），0 分为无色，1 分为浅黄色，2 分为棕黄，3 分为棕褐色。 再按阳性细胞占所观察细胞的百分比打分，0 分为阴性，1 分为阳性细胞≤10%，2 分为阳性细胞＞10%～50%，3 分为阳性细胞＞50%～80%，4 分为阳性细胞＞80%。将染色强度与阳性细胞百分比计分相乘，乘积≥2 分为蛋白表达正常（阳性），乘积等于1 分为蛋白低表达（弱阳性）、乘积等于0 分为蛋白表达缺失或蛋白表达异常（阴性），蛋白低表达和蛋白表达缺失均按阴性表达进行统计。阳性对照为内部核染色阳性的良性肠上皮和（或）淋巴细胞。 结直肠癌组织中至少有一种MMR 蛋白表达为阴性，即发生突变，则将该患者定义为HNPCC 患者。

1.4 统计学方法

所有数据均应用SAS 8.2 统计软件分析，计数资料比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

在94 例结直肠癌组织中，至少有一种错配修复基因表达为阴性的（即HNPCC 患者）共有13 例，占13.83%。 MLH1 蛋白表达为阴性的有3 例，占HNPCC患者的23.08%；MSH2 蛋白表达为阴性的有11 例，占84.62%；MSH6 蛋白表达为阴性的有2 例，占15.38%；PMS2 蛋白表达为阴性的有1 例，占7.69%。 MSH6 蛋白表达阴性的2 例均伴有MSH2 蛋白表达阴性。PMS2 蛋白表达阴性的1 例同时伴有MLH1 和MSH2蛋白表达阴性。 见表1。

表1 13 例MMR 蛋白表达异常的结果

3 讨论

国际癌症研究机构公布的统计数据显示[11]，2008 年全世界有1270 万人患癌症，760 万人死于癌症。 2009 年，我国结直肠癌的发病风险在男性中排第4 位，在女性中排第2 位[12]。 结直肠癌是一种有遗传倾向的肿瘤，世界每年新发的结直肠癌病例中，约15%是家族性的，约10%是遗传性的[9]，HNPCC 是最常见的一种遗传性结直肠癌，占每年新发病例的2%～5%[9]。本研究结果显示，在北京地区住院治疗的94 例结直肠癌患者中，有13 例表现出MMR 蛋白表达缺失， 可诊断为HNPCC，发病率达13.83%，高于世界每年新发病例的水平。

HNPCC 主要由于MMR 基因发生种系突变所致。DNA 的MMR 基因系统能够识别纠正DNA 复制过程中出现的碱基对错配和微小的插入或删除。 MMR 基因的两个家族MutS（MSH2、MSH3、MSH6）和MutL（MLH1、MLH3、PMS1 和PMS2）表达的蛋白形成异二聚复合体，协同作用介导修复错配DNA 的过程[13-14]。在此过程中，MSH2 起识别绑定错配DNA 的作用。MSH6 和MSH3 分别与MSH2 形成MutSα 和MutSβ复合体，募集MutLα（由MLH1 和PMS2 构成）和MutSβ 复合体（由MLH1 和PMS1 构成），介导错配基因识别和酶切修复过程。 因此，MLH1 蛋白和MSH2蛋白是构成错配修复蛋白异二聚复合体的必备蛋白。尽管MSH6 蛋白和PMS2 蛋白表达缺失会影响错配修复蛋白异二聚复合体的构成，但其他蛋白（如MSH3、MLH3 及PMS1 等）可与MLH1 蛋白或MSH2 蛋白结合，起到一定的代偿作用[7]。

HNPCC 国际合作组织对来自全球500 多个HNPCC 患病家族的300 多个不同的致病基因突变的数据进行汇总统计，该基因突变数据库显示[15]：大多数的突变影响了MLH1 和MSH2 两个基因，因为这两个基因的蛋白质产物是参与修复错配DNA 必不可少的成分；在所有MMR 基因突变中，MLH1 突变约占50%，MSH2 突变约占40%，MSH6 突变约占10%，而PMS2突变仅约占2%。 本研究的结果与该数据库统计信息相比，在北京地区住院的HNPCC 患者中，MLH1 基因突变比例相对较低，MSH2、MSH6 和PMS2 基因突变比例均相对较高，但仅有MSH2 基因突变所占比例的差异有统计学意义（P ＜0.05）。 在发生MMR 基因突变的13 例中，仅1 例为PMS2 突变，且与MLH1 和MSH2 同时突变，这与Gill 等[16]报道的PMS2 单独突变率较低的结论相符。

MSH2 突变与HNPCC 的肠外肿瘤高发有关。Vasen 等[17]的研究表明，MSH2 突变基因携带者罹患子宫内膜癌的风险（61%）比MLH1 突变基因携带者（42%）高，但差异不明显；MSH2 突变基因携带者患泌尿道肿瘤、胃癌和卵巢癌的相对风险明显增高。 在本研究中，MSH2 突变致病的比例高达84.62%，提示北京地区HNPCC 患者罹患肠外肿瘤的风险较高。

本研究以免疫组化方法检测MLH1、MSH2、MSH6 和PMS2 四种MMR 蛋白的表达情况，发现北京地区住院的结直肠癌患者中，HNPCC 发病率高于世界每年新发病例的水平，且MSH2 基因突变致病尤为突出。 因此，在临床上对HNPCC 应高度重视，有效地筛查出HNPCC 患者[18-20]。

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