小蓟酸水提取物对巴马小型猪心肌的影响

陈 菲 王建美 裘颖儿 盛柳青

1. 金华职业技术学院药学部，浙江金华 321007；2.浙江省金华食品药品检验所动物中心，浙江金华 321007

小蓟为菊科植物刺儿菜Cirsium Setosum（Willd.） MB.的干燥地上部分，目前也有以菊科植物刻叶刺儿菜Cephalanoplos segetum（Bge.）Kitam.的干燥地上部分作为小蓟入药。 刺儿菜分布于中国大部分地区，在东欧、中欧、俄罗斯东部、日本、朝鲜等地区也有分布。 刺儿菜一般生于荒地、草地、田间、林缘及溪旁，夏、秋二季花开时采割，除去杂质，晒干，生用或炒炭用[1-2]。

小蓟性凉、味甘、苦，归心、肝经，具有祛瘀消肿、凉血止血之功效，用于衄血、吐血、尿血、便血、崩漏下血、外伤出血等。 现代研究表明，小蓟含胆碱、儿茶酚胺类、皂苷、甾醇、有机酸、生物碱等成分，其提取物有明显的收缩血管、缩短凝血时间的作用[3-4]。 为了利用小蓟的药理活性建立巴马小型猪慢性心肌缺血模型，本实验制备了小蓟酸水提取物注射液，采用腹腔注射的方式给药，并以心电图、血清心肌酶谱、心肌染色结果为评价指标考察了该提取物对正常巴马小型猪心肌的影响，现将实验结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

巴马小型猪30 只，雄20 只，雌10 只，体重10～15 kg，月龄3～5 个月，由上海甲干生物科技有限公司提供（许可证号SCXK 沪2010-0028），全价颗粒饲料喂养。

1.2 仪器与试药

恒温水浴锅（杭州蓝天化验仪器厂），旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂），RM6200 型心电图机（成都仪器设备厂），101 型电热鼓风恒温干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司），SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵（深圳市瑞鑫达化玻仪器有限公司），ACS-3 型电子计价秤（金华市征龙衡器有限公司），SGP-P 型不锈钢平板微孔滤膜过滤器（上海格式过滤设备有限公司）。小蓟由金华市药材供应站提供并经金华职业技术学院吴远文副教授鉴定，异丙肾上腺素注射液（0.5 mg/mL，上海禾丰制药有限公司），氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC，Sigma 公司）等。

1.3 小蓟酸水提取物注射液的制备

准确称取干燥的小蓟药材15 kg，切碎，加水浸泡30 min，酸水提取2 次，第1 次加8 倍量的酸水（pH 值2～3）煎煮40 min，第2 次加5 倍量的酸水（pH 值3～4）煎煮30 min。 提取液用双层纱布滤过，合并滤液并浓缩至约7500 mL（每毫升相当于生药2 g）。 浓缩液加乙醇进行醇沉处理2 次，第1 次使含醇量达65%，第2 次使含醇量达85%，每次醇沉后静置冷藏48 h，双层滤纸抽滤，滤液减压回收乙醇，浓缩至3000 mL（每毫升相当于生药5 g）。调节pH 值至4～5，过滤，加注射用水至3800 mL，继续调节pH 值至4～5。 加入0.2%活性炭，煮沸10 min，稍冷后抽滤，滤液加亚硫酸氢钠10g，溶解后，加注射用水至5000 mL。0.45 μm微孔滤膜过滤，灌封（规格为每支5 mL，每毫升含生药3 g），流通蒸汽100℃灭菌30 min。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及处理

试验前小型猪常规饲养7 d，将小型猪30 只随机分为5 组：正常对照组、小蓟酸水提取物低剂量组（低剂量组）、小蓟酸水提取物中剂量组（中剂量组）、小蓟酸水提取物高剂量组（高剂量组）、异丙肾上腺素阳性对照组（阳性对照组），每组各6 只。 每日同一时间腹腔注射给药1 次，小蓟酸水提取物组给予剂量分别为2.0 mL/kg、1.0 mL/kg、0.5 mL/kg（相当于给予生药6 g/kg、3 g/kg、1.5 g/kg），正常对照组给予等量生理盐水，阳性对照组给予异丙肾上腺素1.0 mL/kg（即异丙肾上腺素0.5 mg/kg）。每只动物均给药7 d 后采集数据。

1.4.2 检测指标

1.4.2.1 心电图检测 在做心电图前，各组小型猪采用人力保定（3 人配合把小型猪仰卧固定在专用实验台上，将小型猪四肢用宽纱布固定在实验台四周的铁钩上，轻轻安抚小型猪，使其平复并处于安静状态）。 把小型猪胸部和腿部接触导联部位剃毛后，用75%酒精擦拭导联部位，接上动物专用导电夹，走纸速度25 mm/s，利用心电图机V1 导联描记各组小型猪心电图。

1.4.2.2 血清心肌酶谱检测 各组小型猪采用人力保定，每只于前腔静脉处采血约3 mL[5]，采血后立即离心和分离出血清，避免产生溶血。 精密量取0.5 mL 血清分别置于自动生化分析仪和电化学发光仪上检测，其中血清中的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）和天门冬氨酸氨基转移 酶（aspartate amino transferase，AST）的 检 测 在 自动生化分析仪上完成，CK-MB 采用免疫抑制法检测，其他3 种心肌酶采用速率法检测；血清中的肌钙蛋白T（troponin T，TNT）的检测在电化学发光仪上完成，采用电化学发光法检测。 以上指标的检测均由浙江杭州迪安医学检测中心完成，有配套试剂盒，专人操作。

1.4.2.3 TTC 染色观察心肌变化 各组小型猪随机抽取1 只，在采血和心电图检测完成后，处死，迅速开胸取出心脏，取生理盐水冲洗干净，垂直于心脏长轴，自心尖向心底将心脏切成短轴面切片，然后置于1%TTC 磷酸盐缓冲液中，放入37℃恒温干燥箱20 min 之后在10%福尔马林中固定。 正常心肌染色呈砖红色，坏死心肌呈灰白色或灰黄色[6-7]，观察标本的坏死心肌和坏死范围。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计学处理，对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。 计数资料以率表示，采用χ2检验。 以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验过程中动物的死亡情况

30 只小型猪，阳性对照组在药物注射第5 天死亡1 只，在药物注射第6 天死亡1 只，小蓟酸水提取物中剂量组在药物注射第4 天死亡1 只。

2.2 心电图检测情况

各组小型猪的心电图（图1）所示，其中低剂量组的心电图与正常对照组的心电图基本一致，中剂量组的心电图与正常对照组比较，Q-T 间隙延长，出现较大T 波，且S-T 段（自QRS 波群的终点至T 波起点的一段水平线）稍有抬高现象。 高剂量组的心电图T 波高尖，R 波振幅降低，S-T 段抬高较中剂量组明显，且出现病理性Q 波。 阳性对照组的心电图出现高大T波，S-T 段抬高较其他组明显。 从心电图可以看出，高剂量组和阳性对照组呈典型心肌缺血的心电图。

2.3 血清心肌酶谱检测结果

图1 各组心电图

结果显示：与正常对照组比较，阳性对照组心肌酶谱各指标明显提高，特别是TNT 的升高极显著，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 低剂量组与正常对照组比较，血清各指标差异无统计学意义（P ＞0.05）；中剂量组与正常对照组比较，血清LDH、CK-MB 两指标明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；高剂量组与正常对照组比较，除TNT 升高不明显外，其他指标均有明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 以上血清心肌酶谱检测结果在一定程度上说明了小蓟酸水提取物对心肌的影响与剂量有关。 见表1。

表1 小蓟酸水提取物对小型猪心肌酶谱的影响（）

表1 小蓟酸水提取物对小型猪心肌酶谱的影响（）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05；AST：天门冬氨酸氨基转移酶；LDH：乳酸脱氢酶；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；TNT：肌钙蛋白T

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2.4 TTC 心肌染色结果

阳性对照组发生心肌坏死的范围相对较大，大多分布在室间隔附近，高剂量组在室间隔有少部分发生心肌坏死，中剂量组仅在左心室部分发生很小面积的坏死，低剂量组的心肌呈现完全的砖红色，无心肌坏死发生。TTC 染色结果显示了小蓟酸水提取物在一定程度上能诱发心肌缺血。

3 讨论

本研究组在前期对小蓟不同提取条件下的提取物诱导心肌缺血的实验进行了初步摸索，初步证实了酸水提取物的诱导作用。本次实验采用经典的诱发心肌缺血的药物——异丙肾上腺素作阳性对照[8-9]，观察了不同剂量小蓟酸水提液对巴马小型猪心肌的影响，结果显示高剂量小蓟酸水提液（生药6 g/kg）对诱发心肌缺血有一定作用。这可能与酸水提液中碱性成分相对浓集，而这些碱性成分有可能通过促进冠脉血管收缩和增加心肌耗氧量等多方面机制诱发心肌缺血坏死。至于这些碱性物质的成分有待实验的进一步确证。

本研究组采用了多种评价指标考察小蓟酸水提液对小型猪心肌的影响，其中心电图能较为敏感反映心肌病变状况，因此实验把心电图的异常作为评价心肌缺血的主要指标，同时结合血清中AST、LDH、CK、CK-MB、TNT 等生化指标以及心肌坏死面积等指标来探讨小型猪心肌缺血的程度[10-12]。

心电图出现ST-T 异常改变可间接反映心肌的损伤，当心肌某一部分缺血时，将影响到心室复极的正常进行，并可在与缺血区相关导联上发生ST-T 异常改变。 如出现T 波变化，可表现为出现高大直立的T 波或T 波倒置的情况，还有一个典型表现是发生ST 段偏移，表现为ST 段抬高或压低现象，另外是在心电图上出现病理性Q 波。 心肌缺血的心电图改变类型取决于缺血的严重程度、持续时间和缺血发生部位[13-14]。本次实验中高剂量组出现了高尖T 波和较明显的ST段抬高以及病理性Q 波，验证了小蓟酸水提物对心肌的损伤作用，但其T 波高尖程度和ST 段抬高程度明显不如异丙肾上腺素阳性对照组，这也从侧面说明小蓟引起心肌损伤的程度并不严重。

血清中的各生化指标是心肌缺血、心肌细胞损伤所释放的介质，可以反映心肌缺血及其损伤程度。当心肌细胞发生损伤时，由于细胞内Ca2+超载可激活磷脂酶，使膜磷脂分解和细胞膜的通透性增加，从而导致细胞内的大分子物质包括心肌酶和肌钙蛋白释放到血清中。 这些大分子物质统称为心肌损伤标志物，包括AST、LDH、CK、CK-MB、TNT 等，其中TNT 和CK-MB主要在心肌中分布，因此它们对判断心肌损伤特异性最高[15-16]。 本实验中中剂量组和高剂量组CK-MB 的增加幅度都较其他组心肌酶明显，显示了CK-MB 检测的特异程度，但同时各剂量组TNT 的水平和正常对照组比较差异均无统计学意义（P ＞0.05），而阳性对照组TNT 的水平却很高，这其中的原因有待实验的进一步探究。

TTC 染色是一种用于评价组织内脱氢酶活性的标本染色方法，与组织形态学方法比较，该种染色法成本低廉、简单易行。TTC 是一种脂溶性光敏感物质，1894 年首次合成用以检测种子的生存能力，从1958 年开始用作染料检测哺乳动物的缺血梗死。其主要机制是TTC 能与心肌组织中的脱氢酶反应生成红色物质，正常组织因细胞内具有完整的脱氢酶系统，TTC可通过胞膜进入胞内，与脱氢酶结合反应呈现红色，而坏死组织由于缺乏完整的脱氢酶系统而不染色[17-18]。从本实验心肌染色结果来看，除了低剂量组，中高剂量组都有不同程度的泛白区存在，这也与前面的心电图和血清生化指标的检测存在一致性。

在做小型猪心电图实验时，开始本研究组曾采用静脉注射丙泊酚和戊巴比妥钠的方式使小型猪镇静，但在实验过程中发现，由于麻醉引起动物基础体温下降，小型猪出现颤抖等一系列应激反应，从而导致心电图的基线不稳定，无法得到正常的心电图。 后采用合理人力保定并辅以适当安抚的方式，做出的心电图基线稳定，重复性好。

[1] 冯子明，杨桠楠，姜建双，等.小蓟的化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（6）：87-89.

[2] 祁爱蓉，徐彩，蔡芬芳.小蓟、小蓟炭的主要成份及止血作用研究综述[J].内蒙古中医药，2012，20（10）：96.

[3] 陈毓，丁安伟，杨星昊，等.小蓟化学成分药理作用及临床应用研究述要[J].中医药学刊，2005，23（4）：614-615.

[4] 李丹，吴莲波.中药小蓟的药理作用研究进展[J].黑龙江中医药，2010，（3）：46-47.

[5] 刘亚千，陈华.小型猪基本实验操作技术[J].中国实验动物学报，2008，16（5）：381-384.

[6] 张雷，木胡牙提，林涛，等.TTC 染色识别家猪急性心肌梗死模型中存活心肌的研究[J].中华实用诊断与治疗杂志，2011，25（4）：334-336.

[7] 王燕，胡慧媛，赵美眯，等.TTC 染色评价豚鼠离体心脏缺血/再灌注损伤梗死面积的适宜观察时间及计算方法[J].中国医科大学学报，2013，（2）：70-74.

[8] 朱芬芳，李维祖，张骏艳，等.保心康对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血的保护作用[J].安徽医药，2014，18（8）：19-22.

[9] 张云，王阶，郭丽丽.异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤模型的研究进展[J].医学综述，2010，16（23）：3527-3530.

[10] 高海成，孙波，苗春生.大剂量盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血性坏死模型的建立[J].中国生物制品学杂志，2009，22（3）：288-290.

[11] 刘涛，刘正湘，文莎，等.小型猪急性心肌梗死模型的建立及其评价[J].中国比较医学杂志，2009，19 （3）：10-13.

[12] 庞琳琳，张会永，杨关林，等.巴马小型猪在医学研究中的应用进展[J].中国实验动物学报，2014，22（1）：94-98.

[13] 成建国.心肌缺血的心电图改变及其相关问题[J].西藏医药杂志，2013，34（4）：21-24.

[14] 姚虹.心肌缺血患者的少见心电图图形变化特征[J].基层医学论坛，2013，17（29）：3876-3877.

[15] 洪琼川，李志华，李绍鹏，等.心脏损伤患者心肌酶检测的临床意义[J].中华全科医学，2014，12（7）：1078-1079.

[16] 王卫.急诊检验中心肌酶谱检测的临床意义及必要性分析[J].中国卫生产业，2014，（9）：122-123.

[17] 景松波，郑宏，袁勋，等.在体和离体心肌TTC 染色的对比研究[J].北方药学，2013，10（1）：55.

[18] 王波，李庆志，阎德民，等.不同2，3，5 氯化三苯基四氮唑染色方式对心肌梗死面积检测的对比[J].中国胸心血管外科临床杂志，2011，18（2）：179-180.