过氧化物酶增殖物激活受体-γ和核因子E2 相关因子-2在肾脏衰老中的作用

叶 婷 宁 勇

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院临床营养科，湖北武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科，湖北武汉 430030

衰老是增龄过程中不可避免的结果，往往带来多个器官功能受损。 肾脏是一个血供极其丰富的器官，在衰老过程中肾脏表现最为明显。氧化损伤在人体衰老中发挥着重要作用。过氧化物酶增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）属核激素受体超家族成员，除了具有调解脂质和糖代谢、抗炎调解免疫等重要生理功能，近来还发现其在维持氧化还原稳态方面具有重要意义。核因子E2 相关因子-2（nuclear factor-E2-related factor-2，Nrf2）是新近发现的又一个在氧化应激中起核心作用的转录激活因子。两者是否也在肾脏衰老中发挥作用鲜有报道。 本文拟探讨PPARγ 和Nrf2 在肾脏衰老氧化损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及标本留取

选择SD 雄性大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）20 只，常规条件下于实验动物中心分笼饲养，保持12 h 的昼夜循环，室温控制在23℃左右，湿度维持在40%～50%，自由进食水。将10 只大鼠饲养至3 个月龄（相当于成人20 岁）作为青年组，10 只大鼠饲养至24 个月龄（相当于成人80 岁以上）作为衰老组。断头处死放血干净，生理盐水冲洗肾脏。一侧肾脏迅速纵切分割后，一半置于液氮保存，随后-80℃保存留待蛋白质检测中使用，一半留作病理检查；对侧肾脏立即制备组织匀浆。

1.2 方法

1.2.1 肾脏组织病理学分析 肾脏组织石蜡切片（2～3 μm）常规脱蜡入水，行PAS 染色，普通光镜下观察肾脏组织病理改变。

1.2.2 肾脏组织过氧化氢（H2O2）含量测定 肾脏组织匀浆按照H2O2检测试剂盒（BioAssay System's peroxide assay kit，Hayward，CA））说明书进行。

1.2.3 肾脏组织丙二醛（MDA）测定 肾脏组织MDA 测定采用硫代巴比妥酸法（TBARS）检测试剂盒（Cat#10009055，Ann Arbor，MI），操作参照说明书进行。

1.2.4 Western Blot 法 Western Blot 法检测髓过氧化物酶（MPO）、Nrf2、PPARγ 的蛋白表达水平。分别提取总蛋白和核蛋白，操作参照说明书进行（T-PER®Tissue Protein Extraction Reagent 和NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents，Thermo Scientific）。 各组分别取总蛋白或核蛋白20 μg，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电转移至0.22 μm PVDF 膜上。 5%的BSA 封闭1 h，用MPO（Abcam，ab22604，1∶5000）、Nrf2（Abcam，ab81445，1∶2000）和PPARγ（Santa Cruz，sc-25591，1∶2000）一抗4℃孵育过夜，用TBST 振摇洗膜10 min×3 次，以1∶5000 稀释的羊抗兔生物素标记二抗，室温孵育2 h后，再次用TBST 振摇洗膜10 min×3 次。 ECL 底物化学发光（Supersignal West Dura Kit，Thermo Scientific）显色后机器扫描存盘，以Scion Image 软件进行条带分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.50 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏组织病理学改变

衰老组可见肾小管基底膜增厚皱缩，小管上皮细胞水肿、变性、坏死，部分小管囊状扩张、萎缩，局灶性小管消失，间质增宽，炎症细胞浸润。病变严重区域可见系膜增生，节段性肾小球硬化。 见图1。

图1 肾脏组织病理改变（PAS×400）

2.2 肾脏组织H2O2、MDA 含量及MPO 蛋白表达情况

衰老组肾脏组织H2O2含量较青年组明显升高[（239.90±39.38）μmol/μg 比（110.00±19.49）μmol/μg]，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 衰老组肾脏组织MDA 含量较青年组亦明显升高[（44.42±4.17）μmol/mg 比（26.23±1.43）μmol/mg]，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与青年组相比，衰老组肾脏组织MPO 蛋白表达明显升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。 见图2。

图2 肾脏组织氧化损伤指标检测

2.3 肾脏组织Nrf2、PPARγ 蛋白表达

与青年组相比，衰老组肾脏组织Nrf2 蛋白表达无显著性改变，差异无统计学意义（P ＞0.05）；而PPARγ表达则明显下降，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图3。

图3 肾脏组织Nrf2、PPARγ 蛋白表达情况

3 讨论

中国将是一个不可逆转的老龄社会，伴随老龄化的进程，慢性肾脏病逐年递增。 老年肾脏病的有效防治已成为关系到我国民生的重要公共卫生问题。肾脏是衰老过程中人体器官变化最为明显的器官之一，正常人在超过40 岁后肾小球滤过率平均每年下降1%，形态上表现为体积和重量下降，皮质相对萎缩、肾小球硬化等[1]。衰老是一个极为复杂的过程，受多种因素调控。 目前关于衰老的理论主要有自由基学说、线粒体DNA 损伤学说、端粒学说和衰老的基因学说等。早在1955 年，Harman 发表的“衰老的自由基理论”就提出，体内产生过多自由基是引起衰老的重要因素[2]。伴随增龄，机体抗氧化防御酶体系清除自由基的能力下降，导致体内的自由基代谢紊乱。 自由基对机体组织细胞的损伤累积增加，最终导致组织器官形态机能老化，从而促使机体的衰老。

本研究采用24 个月龄衰老大鼠作为研究对象，比通常使用D-半乳糖造模更能真实反映衰老变化及其机制。 本研究发现，衰老组肾脏组织H2O2及MDA含量明显增加，提示肾脏氧自由基的产生明显增加。同时衰老组肾脏组织MPO 蛋白质表达也明显升高，MPO 能催化反应生成过量的包括次氯酸在内的氧化剂。 这些均提示氧化损伤参与了肾脏衰老的发生，与以往（D-半乳糖造模）研究一致。

PPARγ 属Ⅱ型核激素受体超家族成员，作为一种核受体，与所调控目的基因上游启动子区的过氧化物酶增殖物反应元件（PPRE）结合后发挥对目的基因转录的调控作用，参与调节脂质和糖代谢，具有免疫调节、抗炎等功能。 PPARγ 还在维持机体氧化还原稳态方面具有重要作用[3-4]。在肾脏缺血再灌注大鼠模型中，PPARγ 激动剂匹格列酮能缓解弥漫性肾小管坏死和急性炎性反应，上调SOD1 表达，而下调p47phox和p67phox[5]。 在庆大霉素和顺铂导致的肾损伤中，PPARγ 激动剂均能上调超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等抗氧化酶的表达，减少自由基产生，提高机体抗氧化能力，发挥肾脏保护作用[6-7]。 在高同型半胱氨酸诱导血管性痴呆大鼠模型中，PPARγ 激动剂可以改善学习、记忆功能，提高大脑中GSH 水平，减少自由基产生[8]。在体外衰老模型人二倍体成纤维细胞中，PPARγ 表达明显下降。 而给予PPARγ 激动剂则能通过调节ERK1/2 通路减少H2O2诱导的细胞ROS 产生， 抑制ICAM-1、MMP-2、MMP-9 等炎症因子表达[9]。 PPARγ调节氧化还原状态的机制，一方面是对NF-κB 的抑制作用，另一方面是PPARγ 对机体抗氧化酶表达的直接调节作用。 以CAT 为代表的一些抗氧化酶的启动子区具有PPRE，PPARγ 可以直接结合PPRE，诱导抗氧化酶的基因转录与翻译[10]。 在本研究中发现，衰老组大鼠肾脏组织中PPARγ 表达明显下调，因此可能导致其靶目标的抗氧化酶随之表达不足，导致机体清除自由基的防御能力下降，从而导致肾脏衰老发生。

Nrf2 是新近发现的在氧化应激中起核心作用的转录激活因子，当受到来源于活性氧或亲核剂的信号攻击后，Nrf2 与其胞浆抑制蛋白Keap1 解离，转位进入细胞核，与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合，并介导主要抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如NAD（P）H：醌氧化还原酶（NQO1）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、GPx、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCL）和血红素氧化酶（HO-1）等基因的转录活性。而抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶是机体清除自由基及内源性和外源性有害物质最主要的酶促系统。 因此，Nrf2 对于维持机体氧化还原平衡，应对氧化应激有关键性作用[11-12]。在衰老血管中，Nrf2 和SOD 表达下调同时，伴随着轻度的炎症状态和血管舒张功能不全[13]。 在衰老小鼠的视网膜色素上皮细胞，给予氧化刺激后细胞Nrf2 不能保护性上调，从而导致多种抗氧化酶水平也不能随之升高，细胞清除自由基功能下降[14]。 但在本研究中，衰老大鼠肾脏组织中Nrf2 表达无明显变化。 提示肾脏衰老过程中抗氧化能力的减退并不是由Nrf2 通路介导。

本研究再次证实自由基过度产生所导致的氧化损伤在肾脏衰老中具有重要意义，而抗氧化防御系统功能减退可能由PPARγ 通路介导，而不是由Nrf2 通路介导，其具体的机制与作用还需进一步深入探讨。

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