亚低温对脑出血后非caspase酶依赖性凋亡通路的影响

李晓玲 王满侠 张博 原铂尧 张雯静 张淑娟

脑出血后神经功能恶化的原因有脑水肿的形成，神经细胞死亡等。凋亡在脑出血后神经细胞的损伤中发挥重要的作用。脑出血后线粒体释放细胞色素C，激活各种胱冬酶，导致蛋白酶级链切割最终发生凋亡，此为经典的caspase依赖性通路。近年来研究发现另一种重要的线粒体内介导凋亡的蛋白——AIF，其可以不依赖caspase-3的活性而通过另一条更为原始、更保守的途径来诱导凋亡。研究证实，AIF在神经细胞凋亡中发挥重要的作用[1]。亚低温对神经元的凋亡有明显的抑制作用[2]，但其具体机制尚未明确。目前关于亚低温对caspase依赖性通路的研究较多，但对AIF的研究尚不多见。本实验通过研究亚低温对非caspase依赖性通路中关键蛋白AIF的影响以进一步探讨其减轻神经元凋亡的机制。

1 材料和方法

1.1实验动物SD雄性大鼠108只，鼠龄10～12个月，体质量(275±25)g，由北京天坛医院动物房提供(合格证书编号-604821)。随机分为生理盐水组、脑出血组和亚低温+脑出血组(以下简称亚低温组)，每组再分为脑出血24 h、72 h 、7 d亚组，每个亚组12只。

1.2方法

1.2.1脑出血模型制备：以10%(质量浓度)水合氯醛按体质量400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定于动物脑立体定位仪(美国Benchmark)上。行头皮正中切口，切开皮肤，剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，前囟后1.0 mm中线右3.0 mm处为注射穿刺点(右侧基底节区尾状核)，用牙科钻穿透颅骨，用微量注射器(宁波三爱)抽取股动脉血50 μL，将注射器固定于立体定位仪上，将针尖置于穿刺点平颅骨，垂直进针5.5 mm后，以微量注射泵(美国Benchmark)缓慢注入自体血。生理盐水组以同样方法注入等量生理盐水。造模成功标准：以脑组织中出现明显的圆形、椭圆形或不规则形的血肿为模型成功标准。同时参照Longa及Bederson五级评分法，评分为2～3分者作为成功模型入组。摒除血液针道反流进入脑室或死亡者。

1.2.2亚低温处理方法：将亚低温组大鼠于脑出血后10 min内放在冰毯上用冰块覆盖降温,采用医用电子温度计(大连欧姆龙)间隔15 min监测大鼠肛温，约15 min左右将大鼠肛温降至(33±1.0)℃, 6 h后在室温下自动复温。脑出血组及生理盐水组肛温维持在(37.5±1.0)℃,并于大鼠苏醒后(一般为3 h左右)再次给予10%(质量浓度)水合氯醛按体质量150 mg/kg腹腔注射麻醉。

1.2.3冷冻切片制备：4%(质量浓度)多聚甲醛溶液250 mL经心腔灌注固定，断头取脑，沿针孔冠状面切开，将针孔后2 mm脑标本置于4%(质量浓度)多聚甲醛溶液中固定72 h，后用20%(质量浓度)蔗糖溶液脱水固定72 h，在注射针道平面切取脑组织块后以冷冻切片机(Leica CM1850)行冷冻切片，切片厚10 μm。

1.2.4AIF免疫组化染色:(1)滴加3%(体积分数)过氧化氢抑制5 min，滴加一抗1∶100(羊抗小鼠AIF抗体，购自Santa Cruz公司，货号sc-9416)，4℃过夜；(2)滴加生物素标记的二抗(DAKO K0690)；(3)滴加SABC；(4)DAB显色；(5)苏木素复染，脱水、透明、封片、镜检。采用彩色图像分析仪(BI-2000)进行分析，切片置于高倍镜(400倍)下，随机选取每张切片血肿周围5个视野，测定AIF平均吸光度值。

1.2.5TUNNEL染色：参照原位细胞凋亡检测说明书进行检测(试剂盒购自武汉博士德公司)。主要步骤包括：(1)滴加3%(体积分数)过氧化氢抑制30 min；(2)蛋白酶K 37℃消化30 min；(3)TUNNEL反应混合液，37℃孵育；(4)加入酶标记荧光素抗体37℃孵育；(5)DAB显色，脱水、透明、封片、镜检。采用彩色图像分析仪(BI-2000)进行分析，切片置于高倍镜(400倍)下，随机选取每张切片血肿周围5个视野，计数TUNNEL染色阳性细胞数。

1.3统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组AIF表达比较生理盐水组(注射针道周围脑组织)、脑出血组及亚低温组大鼠脑组织可见AIF免疫阳性细胞。生理盐水组各时间点间脑组织AIF表达无统计学差异(P>0.05)，而脑出血组和亚低温组各时间点AIF表达有统计学意义(P<0.05)。与生理盐水组比较，脑出血组和亚低温组各时间点AIF表达均升高(P<0.05)，而亚低温组各时间点AIF表达较脑出血组降低(P<0.05)。脑出血组AIF的表达于出血后24 h增加，72 h达高峰，7 d后下降(P<0.05)。具体结果见(表1)。

2.2各组TUNNEL阳性细胞比较生理盐水组(注射针道周围脑组织)、脑出血组及亚低温组大鼠脑组织可见TUNNEL阳性细胞。生理盐水组各时间点间脑组织TUNNEL阳性细胞计数比较无统计学差异(P>0.05)，而脑出血组和亚低温组各时间点TUNNEL阳性细胞计数比较有统计学意义(P<0.01)。与生理盐水组比较，脑出血组和亚低温组各时间点TUNNEL阳性细胞计数均升高(P<0.01)，而亚低温组各时间点TUNNEL阳性细胞计数较脑出血组降低(P<0.01)。脑出血组TUNNEL阳性细胞计数于出血后24 h增加，72 h达高峰，7 d后下降(P<0.01)。具体结果见(表2)。

3 讨论

凋亡诱导因子是一种凋亡诱导蛋白，与细胞色素C一样位于线粒体膜，死亡信号诱导AIF释放。AIF在多种组织中广泛分布，其基因定位于X染色体上，在人类定位在Xq25-26,在大鼠位于X染色体A6区。AIF是一个相对分子质量为57的核黄素蛋白[3]，前体蛋白在胞质中合成后，通过其N端的线粒体定位信号有效地穿入线粒体膜间隙，进而成为具有凋亡潜能的成熟AIF分子[4]。在死亡信号或细胞应激的刺激下，线粒体通透性转变孔开放，释放AIF到细胞质溶质中，具有核定位信号序列的AIF便进入细胞核内，引起染色质的初步凝集和DNA大量片段化(约50 kb)，进而引发不依赖于caspase的细胞凋亡途径[4]。AIF的促凋亡作用还在于AIF还可导致线粒体肿胀，改变线粒体外膜的通透性引起AIF和细胞色素C的进一步释放，形成正反馈促进凋亡。

表 1 各组大鼠脑出血后不同时间点脑组织AIF表达(吸光度)比较

注：与生理盐水组比较，*P<0.05；与脑出血组比较，△P<0.05；与同组72 h时间点比较，#P<0.05

表 2 各组大鼠脑出血后不同时间点脑组织TUNNEL阳性细胞计数比较

注：与生理盐水组比较，*P<0.01；与脑出血组比较，△P<0.01；与同组72 h时间点比较，#P<0.01

脑出血后由于血肿的占位效应会造成出血同侧及对侧部位均有不同程度的脑缺血现象。目前已经有大量的研究证实局灶性脑缺血可以引起神经细胞凋亡。脑出血后神经细胞的死亡存在两种形式即坏死和凋亡。本实验结果显示，生理盐水组针道周围可以看TUNNEL染色阳性细胞和AIF表达，表明生理盐水导致的水肿的占位效应可引起针道周围神经细胞凋亡，但在3个时间点其表达差异无统计学意义；脑出血组、亚低温组在3个时间点TUNNEL染色阳性细胞和AIF表达均低于生理盐水组。脑出血组在24 h时血肿周围可看TUNNEL染色阳性细胞，在72 h时其表达达高峰，7 d后下降。这与脑出血后凋亡细胞的形成与脑水肿的变化趋势一致。由此推测，脑出血后引起神经细胞凋亡与脑损伤后caspase-3的表达增加有关[5]。本实验发现，脑出血大鼠脑组织AIF表达于出血后24 h开始增加，72 h达高峰，7 d后下降，但均高于生理盐水组，其变化同TUNNEL染色阳性细胞变化结果相一致。表明脑出血后在各种死亡信号或者细胞胁迫的刺激下，神经细胞的凋亡与AIF的合成增加有关；另外，也与线粒体通透性转变孔开放增加引起AIF的释放有关。实际上细胞凋亡的控制通过整个信号网络完成，多种信号途径相互作用，所以其具体机制比较复杂，推测可能是通过对多个途径的影响来促进出血后凋亡的发生。

本实验结果显示，亚低温组TUNNEL染色阳性细胞表达在脑出血后3个时间点均低于脑出血组，提示亚低温可减轻脑出血后的神经元凋亡。其机制可能与亚低温可减轻脑出血后的炎性反应、抑制神经元凋亡的始动[6]有关；也可能与增强Bcl-2的表达[7]、抑制Bax基因表达[8]、抑制 caspase与 Fas蛋白活性有关。可见，既往针对亚低温对caspase依赖性通路的影响研究较多。本实验通过观察亚低温对非caspase依赖性通路中的关键蛋白AIF的影响，以进一步探讨其减轻神经元凋亡的机制。在本实验中亚低温组大鼠脑组织AIF的表达于24 h、72 h、7 d时均低于脑出血组，与TUNNEL染色阳性细胞的变化一致，提示亚低温可以通过减少脑出血后各种死亡信号和细胞刺激引起AIF表达下降，延缓AIF激活，从而减少神经细胞凋亡，如阻断其引起核DNA凝聚断裂为长的DNA片段导致的细胞凋亡，其具体机制可能为：亚低温可以保持线粒体的完整性，抑制线粒体通透性增加释放AIF至细胞核中，从而阻断AIF引起的DNA大规模断裂；也可能与亚低温阻断AIF的核转移有关。还有研究显示亚低温可通过抑制脑缺血再关注后AIF的转录而减少神经细胞凋亡[9]。本研究结果提示亚低温可有效延缓脑出血后神经细胞凋亡的进程，发挥脑保护作用。

总之，脑出血后的神经元凋亡是由各种凋亡刺激信号始动，受细胞内源性基因、酶和信号传导途径等调控的瀑布式激活过程。亚低温抑制神经元凋亡，可能是对其多个环节的影响，具体有待于进一步研究。

[1]李泽东，马静萍.阿司匹林预处理对大鼠脑缺血再灌注后caspase3和AIF表达的影响[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志, 2009,16:281-284.

[2]Shibano T, Morimoto Y, Kemmotsu O，et al. Effects of mild and moderate hypothermia on apoptosis in neuronal PC12 cells[J]. Br J Anaesth,2002,89:301-305.

[3]Lorenzo HK, Susin SA, Penninger J, et al. Apoptosis inducing factor: a phylogenetically old, capase independent effector of cell death[J]. Cell Death Differ,1999,6:516-524.

[4]Norberg E, Orrenius S,Zhivotovsky B. Mitochondrial regulation of cell death:Processing of apoptosis-inducing factor(AIF)[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,396：95-100.

[5]Ferrer I, Planas AM. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra [J] . Neuropathol Exp Neurol,2003,62:329-339.

[6]Marier CM, Ahen K, Cheng ML, et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation[J]. Stroke,1998,29:2171-2180.

[7]Hocsak E, Racz B, Szabo A,et al.TIP47 confers resistance to taxol-inducing cell death by preventing the nuclear translocation of AIF and endonuclease G[J].Eur J Cell Biol, 2010,89：853-856.

[8]Cabon L,Galan-Malo P,Bouharrour A,et al. BID regulates AIF-medicated caspase-independent necroptosis by promoting BAX activation[J]. Cell Death Differ,2012,19:245-256.

[9]张丽，苏志强，陈丽霞，等.亚低温通过抑制两种凋亡通路对大鼠脑缺血再灌注损伤发挥保护作用[J].中风与神经疾病杂志，2006,23：318-321.