上颌矢状扩弓的动物实验模型的建立

尉静 左艳萍 苑迎娇 刘亚非

Ⅲ类错颌是临床上较常见的一类错颌畸形。其主要临床表现为上颌后缩、下颌前突畸形，面中1/3凹陷以及前牙反牙颌。临床治疗中，对于骨性上颌发育不足的患者，常采用相应的生长改良治疗。目前对乳牙期牙性反颌主要使用简易的颌垫舌簧矫治器解除反颌，但仅用机械力唇倾上前牙而对牙齿反颌进行的纠正，并未对颌骨产生作用。我们在临床中对颌垫矫治器进行改良［1］，在腭部矢状方向置入扩弓器以慢速扩弓的力量施加矢状方向扩弓力，在临床取得了满意的效果。为了解上颌矢状扩弓后是否发生骨改建及其发生的部位，建立有效的动物模型是实验的关键。本实验选择新西兰大白兔，模拟临床上改良颌垫进行矢状方向扩弓，报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组 选择8周龄健康新西兰大白兔15只(河北医科大学动物实验中心提供)，体重1.5～1.7 kg。所有动物单笼喂养观察1周后纳入本实验，所有动物均进食颗粒状饲料，自由摄食饮水。15只处于生长发育期的新西兰大白兔随机分为2组:实验组8只，对照组7只。实验组新西兰大白兔全天戴用自制的上颌矢状扩弓矫治器，对照组不做任何处理为自然生长组。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见［2］。

1.2 实验方法

1.2.1 扩弓装置安放:使用3%戊巴比妥钠以1 ml/kg的剂量对新西兰大白兔进行耳缘静脉注射麻醉，在5～10 min麻醉成功后，使用烤软的牙科用红蜡片制作个别托盘，取上颌工作模型，使用超硬石膏灌注模型。用0.40 mm的澳丝在模型上弯制垂直曲上颌扩弓矫治器。将麻醉后的动物仰卧固定于手术台上，然后用慢速牙科电机安装刃状车针在0.9%氯化钠溶液持续降温的前提下，于上颌两中切牙舌面紧贴龈缘的牙颈部各磨一深约0.2 mm的沟，每一面上的沟水平位于牙面同一水平处。随后将扩弓器的两个游离臂末端向外回折插入第一、二磨牙邻接点之下，用测力计测量(Dontrix，GAC International Inc.)，打开垂直曲使其压缩至实验初始位置时产生150 g的扩张力。加力后将扩弓器前部抵于切牙预备的舌侧沟中，用光固化树脂加固上颌磨牙颌面及切牙舌面。实验期间，实验组新西兰大白兔全天戴用矫治器;对照组不做任何处理，为自然生长组。见图1。

图1 扩弓装置固定在大白兔口中照片

1.2.2 取材及标本处理:所有动物于实验结束前7 d和处死前24 h分2次按25 mg/kg经耳缘静脉注射盐酸四环素(盐酸四环素针剂:为中国药品生物制品检定所所标定的国家标准品。粉剂每支0.5g，盐酸四环素纯度0488－20000198.7%)，扩弓两周后过量麻醉置死，取上颌组织(包括切牙、腭板和腭中缝)，沿两个切牙中间将上颌骨分为左右两半，左侧做HE染色观察组织学变化，将切片在计算机彩色病理图像采集与分析系统中，200倍光镜下选择上颌腭部区域，进行成骨细胞计数。右侧做不脱钙骨磨片观察四环素荧光染色情况，将骨磨片在OLYMPUSAX-80荧光显微镜下放大40倍观察并拍摄照片，观察上颌骨腭部的四环素标记带。应用Metamorph Imaging System V4.5图像分析软件进行四环素荧光积分光密度测算。

2 结果

2.1 一般情况 15只新西兰大白兔除对照组一只由于麻醉制取上颌模型后未苏醒，并确认死亡，分析死亡原因可能与注入麻药过快有关，其余动物均正常存活。一般扩弓装置安装第2天后新西兰大白兔的进食便恢复正常，体质量也开始正常的增长。实验组大白兔扩弓均非常成功，肉眼便可看出前牙覆盖与对照组明显的差别。见图2、3。

图2 实验组

图3 对照组

2.2 组织学观察 实验组HE染色见牵张区为以沿牵张方向排列的胶原纤维束为主，其中可见大量梭形成纤维细胞、未分化的间充质细胞和椭圆形的成骨细胞聚集。上颌骨腭部骨边缘成骨细胞增生活跃，呈带状聚集，成骨细胞的下方有少量类骨质出现。同时部分区域亦可见少量多核的巨细胞，为破骨细胞，但成骨现象大于破骨，有新骨沉积，新生的骨组织骨小梁排列与加力方向一致;对照组的上颌骨腭部可见骨边缘有不等量的成骨细胞和较为微弱的成骨活动，偶见破骨细胞，未发现有明显的类骨质存在。骨细胞计数分析显示:实验组的成骨细胞数量为(27.0±5.904)，对照组的成骨细胞计数为(17.5±3.619)。差异有统计学意义(P＜0.05)。见图4、5。

图4 实验组上颌骨组织(HE×200)

图5 对照组上颌骨组织(HE×200)

2.3 四环素荧光标记观察 实验组由于矢状方向扩弓后新骨的沉积，可以在类骨基质中看到沿牵张方向排列的高亮度散在的黄绿色荧光带出现。同时，在血运丰富及骨改建较好的区域，可以看到数条宽大荧光带平行走行，说明在扩弓过程中出现了较活跃的成骨活动。而空白对照组:由于自然生长，荧光标记沉积带较实验组稀少，可以看到较细窄的黄绿色荧光带沉积。肉眼见强度及面积均不及实验组。经四环素荧光标记积分光密度值(×106)定量分析可见:矢状方向扩弓后，实验组为(0.61±0.16)，对照组荧光四环素标记的积分光密度值为(0.34±0.08)。2组差异有统计学意义(P＜0.01)。见图 6、7。

图6 试验组的四环素荧光带

图7 对照组的四环素荧光带

3 讨论

3.1 动物模型建立 本实验目的之一为建立一种容易推广和使用的上颌矢状方向扩弓的动物模型。新西兰大白兔齿式为2(2 033/1 033)=28，门齿较大，且磨牙为多根牙，性情温顺，生长周期短，4～6个月可达到性成熟［3］。而且对饲养环境的适应性较强，价格低廉，便于进行口腔方面的操作。

本实验建立的动物模型要求能模拟临床上24 h佩戴矫治器，所以扩弓装置应固位稳定不轻易滑脱，能保证实验进程的连续性及实验结果的可靠性;且扩弓装置制作应尽可能简单，安装过程中应减小对动物的损伤，降低新西兰大白兔的病死率。考虑到新西兰大白兔切牙和磨牙的距离相对较远，且可供安装矫治装置的腭部宽度相对狭窄，加力装置安装比较困难，且在咀嚼过程中随着牙齿不断被磨耗并向牙合向生长，使得上颌加力装置容易滑脱，不能在口腔内放置很长时间。经反复预实验最终选择用自制的垂直开大曲代替传统的镍钛螺璜加力方法，使矫治器体积更小，力量不易衰减，能够良好地模拟临床改良牙合垫矫治器给切牙加力的过程，是本实验加力的关键装置。有报道在腭中缝两侧用牙科涡轮钻打孔后将扩弓簧插入腭骨进行扩弓的动物实验方法［4］，该方法需要术后进行常规的肌注抗生素防止感染，感染率与病死率均较高，本实验模型仅用粘接的方式将其固位，在实验过程中没有动物由于实验因素而死亡，而且通过对动物体重量和精神状态等的观察，表明实验组动物能很快适应。

3.2 动物模型评价 研究结果表明，机械力可以打破成骨和破骨的稳态［5］。Gabbay等［6］研究表明机械力对成骨细胞的增殖活性、细胞外形和附着以及表型蛋白表达和功能有重要的影响。实验组动物组织学观察显示:戴用矫治器两周后，实验组上颌骨腭部出现新骨形成反应，其中靠近上颌切牙的牙根处更明显。可能是由于矫治器的力量直接施加在上颌切牙上，即矫治器以磨牙为支持，施力的终端位于切牙部位。导致上颌切牙的牙根处新骨形成更活跃。与对照组相比，实验组成骨细胞数量增多，且形态呈典型的立方状，出现了少量的类骨质，成骨反应活跃。四环素荧光标记显微镜观察也显示实验组上颌骨腭部有大量黄绿色荧光带沉积，荧光强度较强，面积较大，多平行于牵张方向，说明扩弓区内有活跃的新骨形成，是在机械力的作用下由细胞增殖、分化形成的新骨。而空白对照组没有施加机械力，由于自然生长，有较弱的成骨现象。

总之，实验建立的扩弓方式可以引起上颌骨的骨改建。上颌骨矢状方向扩弓后，经四环素标记带和HE染色可直观的反映出来上颌骨腭部的骨组织增生，从而促进上颌骨的生长改建。综上所述，该扩弓实验动物模型科学合理、操作简单、接近临床，不需要繁琐步骤，对动物无创等特点。实验过程中扩弓装置的脱落率极低，不会造成实验步骤的反复，从而保证实验结果的准确性。可以广泛用于上颌骨矢状方向扩弓方面的研究。

1 刘亚非，牛小雷，左艳萍.改良牙合垫舌簧矫治器矫治乳牙反牙合的临床体会.现代口腔医学杂志，2008，22:344.

2 The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China.Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals.2006-09-30.

3 陈主初，吴端生主编.实验动物学.第1版.长沙:湖南科学技术出版社，2003.85-88.

4 Lee K，Sugiyama H，Imoto S，et al.Effects of Bisphosphonate on the remodelong of rat sagittal suture after rapid expamsion.Angle Orthod，2001，71:265-273.

5 苗毅，王林，张卫兵，等.机械扩张力作用下小鼠腭中缝成骨与破骨的研究.口腔医学，2009，29:169-173.

6 Gabbay JS，Zuk PA，Tahernia A，et al.In vitro microdistraction of pre-osteoblasts:distraction promotes proliferation and oscillation promotesdifferentiation.Tissue Eng，2006，12:3055-3065.