复方多西环素缓释凝胶的体内释放度测定

程凤峡 张海芳 杨玉鹏 田华 刘勇

牙周病是牙周致病菌及其毒性产物引发的宿主免疫和炎性反应，是造成牙周组织破坏的主要原因，其最终结果将导致牙周袋形成，牙槽骨吸收，牙齿松动、脱落。近年来，局部用药尤其是局部缓释制剂受到越来越多的关注。多西环素和骨碎补可在牙周治疗中起到抑菌，抑制胶原酶活性，刺激牙周膜细胞增殖及新附着生成等重要作用［1－3］，将其联合应用于牙周局部药物治疗笔者尚未见报导。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是FDA认证的生物可降解高分子聚合物，具有良好的生物相容性和持久的缓释能力［4］。复方多西环素缓释凝胶以多西环素和骨碎补为主药，PLGA为缓释辅料制成凝胶，体外释放试验提示其缓慢释放可长达7 d。本研究应用高效液相色谱法，检测牙周上药后不同时间龈沟液内多西环素的浓度，以确定凝胶的体内缓释效应，指导临床治疗时复诊给药时间。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 岛津LC-20AT高效液相色谱仪，Kromasil C18(100 mm ×4.6 mm，5 μm)，SPD-M20A 紫外检测器，LCsolution色谱工作站，梅特勒AG-254电子天平。多西环素对照品(批号:0485-0401)由中国药品生物制品检定所提供。复方多西环素缓释凝胶(含10%多西环素、骨碎补提取液和适量聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA75∶25)和复方多西环素凝胶(含10%多西环素和骨碎补提取液)均为自制。

1.2 方法

1.2.1 入选条件:按美国牙周病学会制定的牙周炎诊治参照标准［5］，选择我院门诊患者中确诊为中、重度慢性牙周炎病例11例，其中男6例，女5例;平均年龄48.7岁;入选患牙26颗。选择标准:①无全身系统疾病，女性未妊娠或哺乳，无近期受孕计划;②无四环素药物过敏史;③口腔内至少有两颗不在同一象限的牙齿牙周袋探诊深度(PD)≥4 mm、牙龈探诊出血(BOP)(+)，X线片显示牙槽骨有不同程度的吸收;④3个月内未接受过牙周治疗，未使用抗生素或非甾体类抗炎药物;⑤患者了解本实验过程，知情同意自愿参加本实验。

1.2.2 试验设计:本实验采用同一患者口腔内病情相近牙齿的自身对照设计，将患者口内符合纳入标准位于不同象限的牙位随机分为实验组和对照组。入选患者接受口腔卫生宣教，进行彻底的基础治疗。1周后复诊，0.9%氯化钠溶液冲洗牙周袋，隔湿牙面，实验组牙周上药用复方多西环素缓释凝胶，对照组牙周上药用复方多西环素凝胶。上药方法均为将凝胶注射器针头轻轻插入牙周袋袋底，边注射边后退，至袋口有少许凝胶溢出，嘱患者一小时内勿刷牙、漱口及进食。1周内每天定时采集龈沟液样本一次进行药物浓度测定。

1.2.3 龈沟液采集:将whatman3号滤纸裁成规格为2 mm×10 mm的滤纸条，将每两个滤纸条置入一个Ep管中电子天平称量(W1)，备用。隔湿，擦干牙面，将滤纸条分别置于颊侧正中和舌侧正中牙周袋口30 s取出，将滤纸条重新置入Ep管中并称重(W2)。若有血液则弃去，重新釆集。龈沟液的量(W)=W2－W1，并按照1 mg/μl换算成体积，－70℃冰箱避光保存。

1.3 高效液相色谱法测定龈沟液内药物浓度

1.3.1 液相色谱条件:色谱柱:Kromasil C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:乙腈-1‰醋酸铵水溶液(50∶50)，调 pH 值到8.0 左右。流量:1.0 ml/min;柱温:室温;检测波长:350 nm。

1.3.2 辅料干扰试验:取不含多西环素的缓释凝胶约0.1 g注射到甲醇溶液100 ml中，过滤，取滤液进样20 μl。结果在波长350 nm下，辅料在多西环素的保留时间处无吸收，不干扰测定。

1.3.3 空白试验:按龈沟液采集方法用滤纸条取治疗后未上药的龈沟液样本，精密吸取200 μl甲醇溶液加入装有样品的Ep管，超声处理30 min，8 000 r/min离心3 min，取上清液20 μl进样。观察在多西环素保留时间处无吸收峰，不干扰测定。见图1。

图1 GCF的色谱图

1.3.4 标准曲线标准曲线:取多西环素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升中含多西环素1 000 μg的溶液，作为对照品溶液A。精密称取对照品溶液A适量，用甲醇稀释至浓度分别为 0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml，进样20 μl测定峰面积，以峰面积对浓度进行线性回归，得出回归方程为:A=2710.7CX+11249，r=0.9995。结果表明，多西环素在0～500 μg/ml范围内线性关系良好。见图2A。

1.3.5 龈沟液样品内多西环素浓度测定:精密吸取200 μl甲醇溶液加入装有样品的 Ep管，超声处理30 min，使药物充分溶出，8 000 r/min离心3 min，取上清液20 μl进样。根据预先绘制的多西环素标准曲线计算出多西环素的浓度。见图2B。

图2 多西环素的色谱图

2 结果

复方多西环素凝胶在用药后第1天，龈沟液内多西环素浓度为309.71 μg/ml。到用药后第3天，龈沟液内多西环素浓度已降至6.82 μg/ml。

复方多西环素缓释凝胶在用药后第1天，龈沟液内多西环素浓度为425.57 μg/ml，至用药后第3天，多西环素的浓度仍高达208.31 μg/ml，到用药后第7天，龈沟液内多西环素的浓度为60.46 μg/ml。见图3。

图3 应用两种制剂后GCF内多西环素浓度的对比

3 讨论

牙周袋内缓释药物的应用因其方便、无创、药效持续时间长等优点逐渐成为牙周病药物治疗的发展趋势。牙周局部缓释用药的理想标准包括:药物可持续释放较长时间发挥作用，减少毒副作用;对牙周致病菌有较强的杀灭或抑制作用;可促进牙周组织再生;减少上药频率，提高患者依从性;药物可贴附在牙周袋中不易脱落，无不适;缓释载体有良好的生物相容性，可生物降解;剂型便于临床操作，能深入牙周袋底及根分叉处等;但目前临床尚没有一种制剂能满足这些要求［6，7］。

盐酸多西环素不仅能抑制多种牙周致病菌，还能调节宿主防御反应，抑制胶原酶活性和骨吸收，可以减缓牙周组织炎症时的组织破坏［1］。骨碎补具有促进骨折愈合、强骨补肾的功效。近年来很多研究发现骨碎补在牙周组织修复中起重要作用，它可以刺激成纤维细胞的附着和生长，另有实验表明骨碎补可以抑制牙槽骨吸收，促进牙槽骨再生［2，3］。这些药物在牙周组织的作用满足了牙周局部制剂的治疗需要。

将这些药物局部应用并缓慢释放需要一个合适的载体。PLGA是由两种单体(乳酸和羟基乙酸)聚合而成的一种生物可降解高分子有机化合物，其降解产物为乳酸和羟基乙酸，并最终在人体中代谢为二氧化碳和水。由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性且降解速度可控，PLGA材料已经通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典，作为人工导管、药物缓释载体、组织工程支架材料被较为广泛的应用［8，9］。1MP 作为溶剂，GTA 作为增塑剂，均有良好的生物降解性能，对凝胶最终的物理性状起到重要作用，满足了牙周局部凝胶应用方便，可深入牙周袋底部及根分叉区，药物缓慢释放，不易脱落，异物感小等要求。

由于多西环素遇光不稳定，在整个试验过程均应注意遮光操作，避免其分解。本实验中复方多西环素缓释凝胶注入牙周袋内凝结成膜状，黏附于袋内壁不易脱落，结果表明该缓释凝胶在牙周袋内可缓慢释放，至第7天龈沟液内复方多西环素的浓度仍高达60.46 μg/ml，远远高于多西环素对多种牙周可疑致病菌的最低抑菌浓度 0.06 ～6 μg/ml［10］。缓释凝胶中的缓释辅料PLGA遇水凝结形成多孔道骨架，药物可沿多孔道缓慢释放，这在药物缓释中起了主要作用。对照组所用的复方多西环素凝胶比较黏稠，但很难成膜，上药后牙周袋内多西环素的有效浓度也可维持2～3 d，这可能是GTA是凝胶遇水时收缩，凝聚，使药物释放减缓。由于中药成分复杂，单个有效成分的释放由于量比较微小很难监测，因而骨碎补在牙周袋内的释放有待于进一步探讨。

1 曹采方主编.临床牙周病学.第1版.北京:北京大学出版社，2006.279-280.

2 胡其勇，陈莉丽，王仁飞.骨碎补柚皮苷对人牙周韧带细胞增殖和成骨分化潜能的影响.浙江大学学报(医学版)，2010，39:79-83.

3 刘斌，司徒镇强，吴军正，等.枸杞和骨碎补对HGF体外附着影响.中华口腔医学杂志，1992，27:159.

4 The United States Pharmacopoeia Commission Inc.The United States Pharmacopoeia 32-NF27.Rockville:The United States Pharmacopoeia Convention，2009.2212.

5 牙周病诊治的参照标准.美国牙周病学会制定.中华口腔医学会牙周病学专业委员会翻译.2004.

6 毛永利，刘鲁川.牙周药物缓释系统研究进展.口腔医学，2008，28:271-272.

7 Jain N，Jain GK，Javed S，et al.Recent approaches for the treatment of periodontitis.Drug Discov Today，2008，13:932-943.

8 Li M，Panagi Z，Avgoustakis K，et al.Physiologically based pharmacokinetic modeling of PLGA nanoparticles with varied mPEG content.Int J Nanomedicine，2012，7:1345-1356.

9 Khoee S，Rahmatolahzadeh R.Synthesis and characterization of pH-responsive and folated nanoparticles based on self-assembled brush-like PLGA/PEG/AEMA copolymer with targeted cancer therapy properties:A comprehensive kinetic study.Eur J Med Chem.2012，50:416-427.

10 Demetrick W，Frank J，Maria F，et al.In Vitro Activity of Amoxicillin，Clindamycin，Doxycycline，Metronidazole，and Moxifloxacin Against Oral Actinomyces.J Endod，2007，33:557-560.