二苯乙烯苷对大鼠成骨细胞增殖及分化的影响

武继伟

何首乌为蓼科多年生草本植物的块根。一直以来被认为具有益寿延年、延缓衰老之功效，系著名的滋补中药［1］。研究表明，何首乌中的主要水溶性成分为2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D 葡萄糖苷(2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG，二苯乙烯苷)［2］。2000年药典将测定THSG化合物的含量作为何首乌及其制剂的质控标准。典灵辉等［3］发现何首乌的乙酸乙酯提取物能促进大鼠颅骨成骨细胞的增殖，并根据粗提物含量测定结果推测发挥这种作用的物质基础可能是THSG。本研究旨在从细胞水平证实THSG对成骨细胞增殖、分化的影响并初步探明其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 THSG由本实验室提取，经

HPLC检测纯度＞98%;DMEM培养基、优质胎牛血清(Hyclone公司);胰蛋白酶、青霉素G、硫酸庆大霉素(Ameresco公司);MTT试剂、BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所);碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测试剂盒(南京生物建成公司出品);Elisa试剂(Invitrogen公司);其余试剂为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离、培养与传代:大鼠成骨细胞按照文献所述的方法进行分离、培养和传代［4］，实验采用第3～4代细胞。将大鼠成骨细胞以5×104个/皿的密度接种于6孔板中，或以2×104个/孔的密度接种于96孔板中，培养板中的细胞随机分组，进行相应的干预处理。

1.2.2 实验分组与处理

1.2.2.1 细胞增殖测定:采用 MTT试剂盒检测细胞增殖活性。待细胞70%～80%融合时，除阴性对照组外，其余各组加入加入不同浓度的 THSG(0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 和10 mg/ml)，继续培养24 h 后，每孔加入20 ml MTT(5 mg/ml)，培养4 h，吸弃培养基，每孔加入二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μl，振荡10 min，使甲臢充分溶解，在酶标仪上于490 nm波长测定光密度OD值。OD值大小与活细胞数成正比，细胞存活率以对照组为100%，给药组的细胞存活率=给药组的光吸收值(OD)/对照组光吸收值(OD)×100%。

1.2.2.2 细胞ALP活性比测定:于不同浓度二苯乙烯苷干预后第3天检测ALP活性比，采用PBS液漂洗皿中细胞 3 次，每皿中加入 0.1%TritonX 100 500 μl，置于4℃冰箱内12 h，期间将培养皿中裂解液置于－30℃冰箱中反复冻融3次。依据试剂盒说明书流程，检测单位体积裂解液中的ALP活性，同时使用BCA试剂盒检测细胞裂解液中的总蛋白浓度做内参调平，计算每克样本中ALP的活性。

1.2.2.3 Elisa方法检测:应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中c-fos和c-jun水平。在包被单抗的微孔中依次加入c-fos/c-jun抗原、生物素化的抗大鼠c-fos/c-jun抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的c-fos/c-jun呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。给药组c-fos/c-jun的表达水平=给药组的光吸收值(OD)/对照组光吸收值(OD)×100%。

1.3 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以表示，进行one-way ANOVA分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THSG对细胞增殖活性影响 MTT检测结果显示:与对照组比较，在浓度0.03～10 mg/ml范围随浓度内，随着THSG浓度的升高，成骨细胞增殖活性明显增高(P＜0.05 或 ＜0.01)。见图1。

图1 THSG对大鼠成骨细胞增殖活性的影响(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.2 THSG对细胞ALP表达影响 2组成骨细胞ALP活性比检测结果显示:与对照组比较，在浓度0.03～10 mg/ml范围随浓度内，随着THSG浓度的升高，成骨细胞ALP表达显著上升(P＜0.05或 ＜0.01)。见图2。

图2 THSG对大鼠成骨细胞ALP表达的影响(*P ＜0.05 或#P ＜0.01)

2.3 THSG对c-fos和c-jun蛋白表达的影响 经以上处理第3天时，2组细胞c-fos和c-jun表达较对照组明显增高(P＜0.05或 ＜0.01)。见表1。

表1 THSG对大鼠成骨细胞c-fos和c-jun表达的影响±s

表1 THSG对大鼠成骨细胞c-fos和c-jun表达的影响±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01

c-fos 1.00 ±0.15 1.08 ±0.07* 1.20 ±0.15# 1.35 ±0.09#c-jun 1.00 ±0.25 1.10 ±0.03* 1.30 ±0.12# 1.40 ±0.60#

3 讨论

多年来，何首乌的研究大多停留在对何首乌粉、制首乌或何首乌粗提物的功效性探究。采用现代医学手段，深入研究其主要成分的药理作用对中药走向现代化走向世界具有重要意义。

本实验采用MTT比色法检测主要水溶性成分THSG对细胞增殖的影响，具有灵敏度高、重复性好等特点。实验证明，何首乌的THSG在0.03～10 mg/ml的宽广范围内有明确的促进成骨细胞增殖的作用，表现出高效、低毒的特点。

碱性磷酸酶ALP是成骨细胞分化的主要特征性酶之一，可以水解有基磷酸酯，提高局部无机磷离子的浓度，促进钙化的发生。对ALP活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指标之一。本研究显示，保持较高的ALP活性是THSG体外促进大鼠成骨细胞分化成熟的典型特征之一。

C-fos和c-jun是与细胞增殖相关的原癌基因，是调控细胞分化和发育的即刻早期基因，亦称快速反应基因，因在外界因素刺激后迅速表达而得名［5］。C-fos和c-jun在正常情况下大多数细胞内均有低水平的表达。在外来因素刺激下，c-fos和c-jun经过广泛的修饰加工后跨核膜进入细胞核内，二者通过亮氨酸拉链形式1∶1构成异源二聚体或同源二聚体，与靶基因上调节区转录激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)结合位点相结合后影响靶基因表达，与细胞增殖密切相关。本研究中，THSG显著诱导c-fos和c-jun，可能是其促进增殖和破骨细胞的分化、成熟的机制之一。

1 吕丽爽.何首乌中二苯乙烯苷的研究进展.食品科学，2006，27:608-615.

2 张纯，杨少麟.高效液相色谱法测定何首乌中二苯乙烯甙的含量及其稳定性考察.中国中药杂志，1999，24:357-360.

3 典灵辉，程纪伦，陆江赢，等.德庆何首乌提取物对成骨细胞增殖的影响.安徽农业科学，2012，40:8885-8886.

4 韩娜，王天兵，寇玉辉，等.人工虎骨粉干预大鼠成骨细胞增殖和Ⅰ型胶原的表达.中国组织工程研究，2012，16:201-205.

5 武密山，赵素芝，任立中，等.柚皮苷对乳鼠成骨细胞增殖及c-fos、cjun表达的影响.中国药理学通报，2011，27:677-681.