丹皮酚对人黑素瘤A375和M14细胞系增殖与凋亡的影响

陶 玥张孟丽马鹏程∗孙建方周武庆包 军

丹皮酚对人黑素瘤A375和M14细胞系增殖与凋亡的影响

陶 玥1张孟丽2马鹏程2∗孙建方2周武庆2包 军1

目的: 确定丹皮酚对体外培养人黑素瘤A375和M14细胞增殖与凋亡的影响。方法: 利用CCK8检测黑素瘤A375和M 14细胞的增殖抑制率；以流式细胞仪检测细胞周期变化、Annexin－V/PI法观察细胞凋亡的变化；用Hoechst33258染色法观察细胞凋亡的形态变化。结果: 细胞周期显示丹皮酚处理过的A375和M 14细胞G2/M期比例均高于对照组。以0 mmol/L、1.25mmol/L、2.5 mmol/L、5mmol/L丹皮酚作用24 h后，A375细胞的早期凋亡率分别为3.11%±0.53%，13.74%±1.73%，25.95%± 0.57%和46.44%±0.81%；M14细胞的早期凋亡率分别为1.00%±0.08%，2.00%±0.01%，2.99%±0.29%和14.73%±0.94%，呈剂量依赖性诱导A375和M14细胞凋亡。经5 mmol/L丹皮酚作用后Hoechst33258染色示凋亡细胞形态改变。结论: 丹皮酚对黑素瘤A375和M14细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。

丹皮酚； 黑素瘤； A375； M 14； 凋亡

丹皮酚(TP)又称牡丹酚，是分离自中药牡丹及芍药的干燥根皮和徐长卿的根或全草中的一种小分子酚类化合物。研究证明丹皮酚有抗过敏与抗炎、免疫调节、抗微生物感染、抑制黑素合成等多种活性作用。1－4近年来丹皮酚的抗肿瘤作用也逐渐引起注意，现已证实其对食管癌、肝癌等多种肿瘤具有抗增殖、促凋亡的作用。5，6本研究以体外培养的人黑素瘤A375和M14细胞为实验研究对象，观察丹皮酚对黑素瘤细胞的生长抑制作用及诱导凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 丹皮酚购自中国药品生物检定所(纯度＞99.0%)；二甲基亚砜(DMSO)、1%抗生素/抗真菌溶液、Hoechst33258购自Sigma公司，胰酶、1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自上海吉泰公司。CCK8试剂盒购自日本同仁化学公司，细胞周期检测试剂盒购自英国Beckman Coulter公司，Annexin－V/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 使用含10%胎牛血清的1640培养基，在37℃、5%CO2的孵箱中培养A375、M14细胞，取对数生长期的细胞用于各项实验。

1.2.2 药物配制 丹皮酚溶解于DMSO后稀释于1640培养基，其终浓度分别为:0.5 mmol/L、1 mmol/ L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L；DMSO在培养基中的最大终浓度低于0.2%，经预实验证实对细胞增殖无影响。

1.2.3 CCK8检测细胞增殖抑制率 分别将对数生长期的A375和M14细胞按1×104/孔分别接种于96孔板，在37℃及5%CO2下孵育24 h，去上清液，每孔加入含一定浓度丹皮酚(0.5，1，2，4，8 mmol/L)的1640培养基100μL，每一浓度设3个复孔，对照组直接加含有DMSO的1640培养基100μL，空白孔不加细胞，只加含有DMSO的培养基，分别培养24，48和72 h后，吸出培养基，以1640培养基小心洗涤细胞2次，每孔加入100μL 1640培养基，再加入10μL CCK8溶液，在37℃及5%CO2下孵育2 h，在酶标仪450 nm波长下测量各孔吸光度值，细胞增殖抑制率＝[1－(待筛物各浓度平均吸光度值－空白组平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值－空白组平均吸光度值)]×100%。

1.2.4 丹皮酚对细胞周期的影响 分别收集经0，1.25，2.5，5 mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375和M14细胞，吹打制成单细胞悬液，调整浓度至1×106个细胞/mL，以PBS洗涤后制成100μL细胞悬液，加入100μL细胞裂解液涡旋7秒，再1 m L染液(碘化丙啶及RNA酶混合液)，室温避光放置30 min，1 h内以流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.5 丹皮酚细胞凋亡率的影响(乙硫氰酸荧光素(Annexin V)－FITC/碘化丙啶(PI)双染法) 收集经0，1.25，2.5，5 mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375和M14细胞，预冷的PBS洗涤两遍，以1×连接缓冲液将细胞密度调整为1×106/m L，每管加Annexin V－FITC 5μL、PI 5μL，轻轻震荡混匀，室温避光染色l5 min，每管加400μL 1×连接缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态将经5mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375和M14细胞以PBS洗涤后以4%多聚甲醛固定10 min，Hoechst33258(5μg/mL)避光染色20 min，弃去染液，甲醇漂洗1次，滴加甘油，以紫外光340 nm波长激发，荧光显微镜下拍照观察细胞凋亡形态学改变。以只含DMSO的培养基处理过的A375和M14细胞作为对照组。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行t检验，数据以¯x±s表示。

2 结果

2.1 CCK8检测细胞增殖抑制率 与空白对照组比较，0.5，1，2，4，8mmol/L丹皮酚作用24，48，72 h均对A375和M14细胞有抑制作用，且与时间、浓度呈依赖关系。随着药物浓度的增加和作用时间的延长，丹皮酚对A375、M14细胞的生长抑制率逐渐增高(图1、2)。除作用A375细胞24 h的0.5mmol/L浓度组外，各组与对照组比较差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。丹皮酚处理A375细胞的24、48和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别约为5.19 mmol/L，1.50 mmol/L和1.09 mmol/L，M14细胞24、48和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别约为4.11 mmol/L，1.60 mmol/L和1.17 mmol/L。

图1 丹皮酚对A375细胞增殖抑制率的影响(n＝3)

图2 丹皮酚对M 14细胞增殖抑制率的影响(n＝3)

2.2 流式细胞术检测细胞周期 三种浓度(1.25，2.5，5 mmol/L)丹皮酚作用A375和M14细胞48 h后，G2/M期细胞百分比均较对照组升高，呈剂量依赖性(表1)。除1.25 mmol/L作用A375细胞组外，各组与对照组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。图3、4为代表性的细胞周期流式结果图。

表1 丹皮酚对A375、M14细胞G2/M期的影响

2.3 Annexin V－FITC/PI双染法检测细胞凋亡率见表2。丹皮酚对于黑素瘤细胞A375和M14均具有促凋亡作用，作用24 h后，随着药物浓度的升高(0，1.25，2.5，5 mmol/L)，A375和M14细胞的早期凋亡率均逐渐增高，各浓度丹皮酚组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01)。图5、6分别为丹皮酚对A375及M14细胞凋亡率影响的流式结果图。

2.4 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡形态 荧光显微镜下观察，对照组A375和M14细胞的Hoechst33258染色淡而均匀，细胞形态规则，较一致。而经5mmol/L丹皮酚作用24 h的A375和M14细胞核染色加深呈强蓝色荧光，形态不规则，大小不一，且伴有染色质固缩、核碎裂等现象(图7)。

表2 丹皮酚对A375和M14细胞凋亡的影响

图3 丹皮酚对A375细胞周期影响的流式结果图

图4 丹皮酚对M14细胞周期影响的流式结果图

图5 丹皮酚对A375细胞凋亡率影响的流式结果图

图6 丹皮酚对M 14细胞凋亡率影响的流式结果图

图7 a，c分别为正常A375、M14细胞；b，d分别为5mmol/L丹皮酚作用24 h后的A375、M14细胞(Hoechst33258染色法，×400)

3 讨论

皮肤黑素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是一种高度恶性的皮肤肿瘤，该病早期极易发生血行及淋巴转移，目前的治疗方法以外科手术切除为主，药物治疗效果不理想，因此，寻求有效、低毒的抗肿瘤药物一直受到国内外医学界的重视，而从植物中寻找活性化合物一直是其热点。

丹皮酚药理活性广泛，临床多用于心脑血管、炎症、变态反应及免疫系统等疾病。7近年来研究发现，丹皮酚还具有一定的抗肿瘤活性，能抑制多种肿瘤细胞如肝细胞癌、卵巢癌、人神经母细胞瘤等的增殖，诱导其凋亡。6，8，9而针对黑素瘤这方面的研究尚未见报道。本研究即观察多个浓度丹皮酚对黑素瘤细胞系A375、M14细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，探讨丹皮酚抗皮肤黑素瘤可能的作用机制。

本研究结果表明，丹皮酚能抑制皮肤黑素瘤A375、M14细胞的增殖活性，且这种作用随着药物浓度的升高和作用时间的增加而逐渐增强，具有浓度和时间依赖性。A375和M14细胞在丹皮酚作用24 h的IC50分别为5.19 mM和4.11 mM，提示作用24 h时，A375较M14对丹皮酚的抗增殖作用更为敏感。比较丹皮酚在食管癌、肝癌等肿瘤中的抑制增殖浓度较其在黑素瘤中的略低，即黑素瘤细胞对丹皮酚的抗增殖敏感度较消化道肿瘤低。5，6

流式检测细胞周期结果示:丹皮酚分别作用于A375、M14细胞24 h后，G2/M期细胞百分比均随药物浓度的增加而逐渐升高，而S期、G0/G1期则均未见规律性变化。细胞的G2/M期主要负责进行细胞的有丝分裂，因此丹皮酚通过阻断黑素瘤细胞在G2/ M期，阻滞细胞分裂，可能为其抑制黑素瘤细胞增殖的机制之一。此外，有研究显示丹皮酚可阻滞肝癌HepG2细胞和食管癌SEG－1、ECA－109细胞在S期，5，6说明丹皮酚可将不同类型的肿瘤细胞阻断在不同周期，其对细胞周期的作用具有细胞特异性。

流式细胞术检测细胞凋亡率显示1.25，2.5，5 mmol/L丹皮酚作用于黑素瘤细胞24 h后，对A375和M14细胞的诱导凋亡作用具有浓度依赖性，A375细胞早期凋亡率分别为13.74%、25.95%、46.44%，M14细胞早期凋亡率分别为2.00%、2.99%、14.73%，与对照组相比均有统计学差异。研究显示丹皮酚在结直肠癌等细胞中的促凋亡浓度同为毫摩尔数量级，10说明该肿瘤与黑素瘤对丹皮酚抗凋亡的敏感性相当。比较丹皮酚作用24 h后两种细胞凋亡率的变化发现，A375细胞的凋亡率更高，提示作用24 h时，A375较M14对丹皮酚的诱导凋亡作用更为敏感。经丹皮酚作用后的黑素瘤细胞株A375和M14细胞在染色后荧光显微镜下可观察到出现凋亡的形态学改变，也证实了凋亡的发生。

本研究结果证实，丹皮酚对人黑素瘤细胞系A375、M14具有抑制增殖和促凋亡的作用，荷瘤动物试验其具体作用机制将在后续工作中进一步探讨。

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5 Sun GP，Wan X，Xu SP，et al.Antiproliferation and apoptosis incuction of paeonol in human esophageal cancer cell lines.Dis Esophagus，2008，21(8):723－729.

6Chunhu Z，Suiyu H，Meiqun C，et al.Antiproliferative and apoptotic effects of paeonol on human hepatocellular carcinoma cell.Anticancer Drugs，2008，19(4):401－409.

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(收稿:2013－11－11 修回:2014－01－01)

Effects of paeonol on the proliferation and apoptosis in hum an m elanoma cell line A375 and M 14

TAO Yue，ZHANGMeng-li，MA Peng-cheng，et al.Department of Dermatology，Drum Tower Hospital，Nanjing，210042

Objective:To determine the effects of paeonol on the apoptosis and proliferation in humanmelanoma cell line A375 and M 14.Methods:The anti－proliferative activity of paeonol in A375 and M 14 cells was investigated by CCK8 assay.After A375 and M14 cells were treated by 1.25 mmol/L，2.5 mmol/L or 5 mmol/L paeonol for 24 h，flow cytometrywas used to detect the cell cycle and Annexin V－FITC and propidium iodide(PI)double staining was taken to detect the apoptosis rate of A375 and M14 cells，respectively. Themorphological changes of A375 and M14 cells treated by 5mmol/L paeonol for24 h were observed by Hoechest 33258 staining.Results:Compared with untreated A375 and M14 cells，an increase of cell population in G2/M phase was observed in paeonol－treated cells.After treatment of 0 mmol/L，1.25 mmol/L，2.5 mmol/L and 5 mmol/L paeonol for 24 h，the early apoptosis rate of A375 cellswas 3.11%±0.53%，13.74% ±1.73%，25.95%±0.57%and 46.44%±0.81%，respectively，while the rate of M14 cells was 1.00%± 0.08%，2.00%±0.01%，2.99%±0.29%and 14.73%±0.94%，in a dose－dependentmanner.After treated with paeonol of 5 mmol/L，there were morphological changes of apoptosis in A375 and M14 cells.Conclusion:Paeonol can inhibite proliferation and induce apoptosis of human melanoma cell line A375 and M14.

paeonol；melanoma；A375；M14；apoptosis

1南京大学医学院附属鼓楼医院皮肤科，南京，210008

2中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，南京，210042

陶玥，张孟丽并列第一作者。

∗通信作者