血热证银屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表达

曹筱筱 徐 蓉 李福伦 王一飞 范 斌 李 峰 李 斌 陈 洁

血热证银屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表达

曹筱筱 徐 蓉 李福伦 王一飞 范 斌 李 峰 李 斌 陈 洁∗

目的: 确定血热证银屑病患者Th1/Th2/Th17主要细胞因子与银屑病血热证候的相关性。方法: 分别采用流式细胞技术(FACS)及酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测外周血单个核细胞(PMBCs)及血浆Th1/Th2/Th17细胞分泌主要细胞因子的表达。结果: 血热证银屑病的CD4＋IFN－γ为26.06±11.86较正常对照12.35±6.52升高(P＜0.05)；CD4＋IL－4＋及CD4＋IL－17＋较正常对照稍降低(P＞0.05)。IFN－γ为91.20±48.37较正常对照47.44±21.46升高，而IL－4较正常对照下降(P＜0.05)。IL－17的水平两组无统计学差异。结论: 血热证银屑病Th细胞免疫机制节点起主导作用的细胞亚型及细胞因子可能为Th1型，主导细胞因子为IFN－γ。

银屑病； 血热证； Th细胞

银屑病是一种以皮肤的红斑鳞屑为主要临床表现的常见慢性复发性疾病，病理表现为炎症性表皮过度增生，发病率高。1银屑病中医称之为“白疕”，认为本病病位在血分，急性期多以血热为主，壅于肌表而发，兼风、寒、湿等因素；静止期以血瘀为主，缓解期则以血虚为主。根据临床表现将其分为“血热证、血瘀证、血虚证”三个证候，在疾病发展的过程中，各个证候可以相兼且有所侧重，直至相互转化。本课题分别检测寻常型银屑病血热型患者Th细胞的3种细胞因子IFN－γ、IL－4、IL－17，且与正常对照组进行比较。以明确寻常型银屑病(PV)血热型患者起主导作用的Th细胞类型及其细胞因子，继而筛选PV血热证侯分型的标志性细胞因子。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2011年7月至2012年4月上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科门诊及病房有完整记录的血热证银屑病患者30例，男19例，女11例；年龄20～65岁，平均46.36±13.04岁；其病情严重程度PASI评分为1.20～23.20分，平均10.35± 5.84分。正常对照为健康体检者30名，其中男17名，女13名，年龄20～39岁，平均27.31±1.398岁。

西医诊断标准2银屑病进行期:皮肤损害以红色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片为主，上覆多层银白色鳞屑，刮除鳞屑可见一层光亮的薄膜，薄膜下有点状出血(Auspitz征)。发病急，新疹多且不断有新发疹出现，可见同形反应(Koebner现象)。

中医证型诊断标准3血热证:新皮疹不断出现，以丘疹、斑丘疹为主，疹基底皮肤颜色鲜红，刮去鳞屑见点状出血，可有同形反应。初发或复发，可有不同程度的瘙痒，心烦口渴或口干，便秘尿黄，舌质红，苔黄，脉数。

纳入标准:明确诊断为寻常型银屑病血热证；年龄18～65岁；病程0～20年；所选病例均为新发或最近3月未作任何治疗，且无其他疾病史者。排除标准:3个月内曾采用系统治疗，包括大面积外用强效糖皮质激素、免疫抑制剂；合并有心、脑血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病，精神病患者。

1.2 试剂和仪器 流式细胞仪检测使用试剂及仪器:RPMI1640培养液、胎牛血清、淋巴细胞分离液均由PA公司提供；佛波酯(PMA)、离子霉素(ionomycin)购自美国Sigma Aldrich公司；莫能霉素(monensin)、T细胞表面抗体:抗人CD4 PE、细胞因子抗体，抗人IFN－γ、FITC及抗人IL－4 PE－Cy7均购自美国eBioscience公司；流式细胞仪(MACSQuant SN2187)由德国Miltenyi公司生产。

酶联免疫吸附测定法使用试剂及仪器:抗人IFN－γ、IL－4、IL－17A；ELISA试剂盒由西塘科技生物有限公司提供；酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)及洗板机(Wellwash 4 MK2)由芬兰Thermo公司生产；具体步骤:参见试剂盒内说明书。

1.3 方法 抽取患者及正常人外周静脉血5 mL(肝素抗凝)；1000 r/min离心×5 min后取血浆－80℃冰箱冻存备测ELISA部分实验；采用密度梯度离心法分离单一核细胞(PBMCs)；取分离出PBMCs，5000 r/ min离心×5 min；去上清后再加磷酸缓冲液(PBS)，再次5000 r/min离心×5 min；吸弃上清，加250μL PBS重悬，200μL/孔PBMC细胞悬液铺入96孔板加试剂(PMA 100 ng/m L，离子霉素1μg/mL，莫能霉素2 μmol/L)，刺激6 h后收细胞；300μL PBS，2000 r/min振荡离心×5min；去上清后加50μL PBS，再加5μL CD4，孵育10 min后；加300μL PBS，2000 r/min振荡离心×5 min；去上清加胞内固定液500μL；30 min后再加500μL胞内穿膜液离心2000 r/min×5 min；去上清加70μL胞内穿膜液，分别加抗体IFN－γ、IL－4和IL－17A后振荡过夜；加500μL胞内穿膜液振荡离心2000 r/min×5 min；去上清加300μL胞内穿膜液上机。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计。计量资料以¯x±s表示，符合正态分布，则用t检验。

2 结果

见表1、2。从表可以看出血热证银屑病患者的CD4＋IFN－γ＋较正常对照升高(P＜0.05)，差异有统计学意义。CD4＋IL－4＋及CD4＋IL－17＋较正常对照降低(P＞0.05)，差异无统计学意义。血浆中IFN－γ较正常组有明显升高(P＜0.05)，而血浆中IL－4较正常组下降(P＜0.05)，差异有统计学意义。血浆中IL－17较正常略有上升(P＞0.05)，差异无统计学意义。

表1 流式细胞仪检测结果

表2 酶联免疫吸附测定法结果

3 讨论

银屑病病因病机比较复杂，几千年以来中医各家对银屑病的辨证论治观点各异，大部分的学者主张银屑病从血分辨证为主，治疗上也都从血入手，赵炳南4辨证分为3型:血热证，血燥证，血瘀证。

现代医学研究表明，5寻常型银屑病的发病机制与异常T细胞导致表皮角质形成细胞过度增生有关。银屑病的Th细胞主要向Th1及Th17方向分化，Treg起到微调上述分化的作用，而Th2则具有抑制上述分化趋向。6，7其中IFN－γ及IL－12促使Th向Th1分化并分泌IFN－γ、TNF－α等因子，Tbet是其关键的信号转导因子；IL－4诱导Th向Th2分化进而分泌IL－4、IL－5等因子，GATA3是其关键的信号转导因子；IL－6、IL－23及TGF－β促使Th向Th17分化并分泌IL－6、IL－17及IL－22，RORγt是其关键的信号转导因子。8

通过本次研究可以发现，血热证银屑病患者血浆IFN－γ与外周血PBMCs中CD4＋IFN－ν＋均较正常组有明显升高，两者结果一致，表明血热证银屑病患者以Th1细胞占优势主导地位。而血热证银屑病患者外周血PBMCs中CD4＋IL－4＋、CD4＋IL－17＋与血浆IL－4、IL－17的改变与正常对照均无明显差异。上述结果提示Th2及Th17细胞在血热证银屑病中不具有特殊的意义。

本课题通过两种方法来检测血热证银屑病患者3种Th细胞的代表性细胞因子IFN－γ、IL－4、IL－17，两者的结果基本一致。酶联免疫吸附测定法其特异性不如流式细胞技术高，检测的IFN－γ、IL－4、IL－17不仅仅由Th细胞分泌，其他细胞也会少量的分泌，但是通过酶联免疫吸附测定的结果可以对血热证银屑病做一个大致的判断。

本研究检测的三类Th细胞及其细胞因子只是针对于血热证银屑病患者，其与正常对照比较，初步发现了此类型的患者Th1细胞及其细胞因子的表达较其他Th细胞比较占明显的主导地位。但是对于血热证银屑病患者与其他证型的银屑病患者在此三类Th细胞及其细胞因子之间是否有差异，有待于进一步的研究来证实。

1Blauvelt A，Bichenbach JR，Dulesz－Martin MF，et al.Montagna symposium 2008:the biologic basis of posriasis.J Invest Dermatol，2009，129(2):259－260.

2赵辨.临床皮肤病学.3版.南京:江苏科学技术出版社，2001. 759－772.

3上海市卫生局.上海市中医病症诊疗常规.2版.上海:上海中医药大学出版社，2005.231－234.

4赵炳南，张志礼.简明中医皮肤病学.北京:中国展望出版社，1983.9:200－203.

5Oritz A，Yamauchi PS.A treatment strategy for psoriasis transitioning from systemic therapy to biologic agents.Skinmed，2006，5(6):285－288.

6Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleukin 17－producing CD4＋effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.Nat Immunol，2005，6 (11):1123－1132.

7 Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4 cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.Nat Immunol，2005，6(11):1133－1141.

8Weaver CT，Harrington LE，Mangan PR，et al.Th17:an effector CD4T cell lineage with regulatory T cell ties.Immunity，2006，24:277－688.

(收稿:2013－10－30)

The expression of Th1/Th2/Th17 in peripheralblood of the patientsw ith b lood－heat syndrome of psoriasis

CAO Xiao-xiao，XU Rong，LIFu-lun，et al.Yueyang Hospital of Integrative Chinese＆Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，200437

Objective:To determ ine the association between Th1/Th2/Th17 cytokines，and blood－heat syndrome of psoriasis.Methods:Flow cytometry and ELISA were applied to test Th1/Th2/Th17 cytokines in the peripheral blood of the patientswith blood－heatsyndrome of psoriasis and healthy controls.Results:CD4＋IFN－γ＋was higher in the patients with blood－heat syndrome of psoriasis than in the healthy controls，with a significant difference between the two groups(P＜0.05)，but the level of CD4＋IL－4＋and CD4＋IL－17＋was lower than healthy controls(P＞0.05).The level of IFN－γwas higher in the patients with blood－heat syndrome of psoriasis than in healthy controls.The level of IL－4 was lower in the patientswith blood－heat syndrome of psoriasis than in controls(P＜0.05).There was no significant difference in the level of IL－17 between the two groups(P＞0.05).Conclusion:Themajor Th cell immunemechanism in blood－heat syndrome of psoriasis was Th1 cell and themajor cytokineswas IFN－γ.

psoriasis；blood heat syndrome；Th cells

上海市自然基金(编号:11ZR1438000)

上海市高级中西医结合人才培养计划(编号:ZYSNXD012－RC－ZXY010)

上海市卫生局项目(编号:2011XY004)

上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院皮肤科，上海，200437

∗通讯作者