ADAM33基因多态性与东北汉族银屑病的相关性

周 婧 徐 鹏 杨 波 柏冰雪 孙丽艳 孙东林

ADAM33基因多态性与东北汉族银屑病的相关性

周 婧 徐 鹏 杨 波 柏冰雪 孙丽艳 孙东林

目的: 确定解整合素金属蛋白酶(ADAM 33)基因与东北地区汉族人群银屑病的相关性。方法: 利用多重SNaPSHOT方法检测东北汉族400例银屑病患者和398名正常对照的ADAM 33基因中rs2787094、rs512625、rs597980位点的基因分型。比较患者和对照组间、不同临床表型组间的基因型、等位基因和单体型频率分布的差异性。结果: ADAM33基因rs2787094CC、CG基因型和2个单体型(H3和H5)可能为银屑病的危险因素(P＜0.05)，rs512625AA基因型和3个单体型(H1、H4和H7)可能是银屑病的保护因素(P＜0.05)。rs597980的基因型和等位基因在病例和对照组间无差异(P＞0.05)。rs2787094CC基因型和C等位基因可能与晚期发病和/或无家族史的患者具有相关性，与病情严重程度和性别无关。结论: ADAM33基因的多态位点与东北地区汉族人群银屑病具有相关性。

银屑病； 解整合素金属蛋白酶33； 多态位点

最近，一些研究表明银屑病可能与ADAM33具有相关性。1－4人类ADAM33(hADAM33)基因是ADAM家族成员之一，位于20号染色体短臂13区(20p13)，在包括皮肤在内的多种组织中广泛表达。5目前，ADAM33基因已被确定为哮喘易感基因，同时也发现ADAM33与许多免疫介导疾病具有相关性。6－9ADAM33参与细胞表面蛋白的脱落，可能与银屑病有关。

Lesueur等在对46例法国斑块型银屑病家系全基因组扫描中发现了位于20p13的一个银屑病的易感基因ADAM33；1随后，分别在法国、北美和中国南方人群中得到验证。2－4本研究采用分子生物学和生物信息学等手段，通过对ADAM33基因中多态位点的基因型的分布频率检测，来确定ADAM33基因多态位点在北方汉族人群银屑病中的分布频率，并通过关联分析，进一步研究基因型与表型的关联性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 银屑病病例组:银屑病病例样本取自2008年10月至2010年5月到哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科门诊就诊的银屑病患者，共计400例。所有患者均经过两名皮肤科医师的严格诊断确诊，符合寻常型银屑病的诊断标准。10并且根据银屑病的严重程度、发病年龄、有无家族史以及性别进行分组。11

正常对照组:正常对照样本共计398名，取自哈尔滨医科大学附属第二医院体检中心。正常对照个体家族中无银屑病患者，而且无其它免疫炎症性疾病。研究对象的性别、年龄在病例－对照两组中匹配完全(表1)。

所有受试者之间无血缘关系，采集受试者外周静脉血3～5 m L，ACD抗凝，于－70℃保存。全部受试者均签署知情同意书。

表1 研究对象临床特征

1.2 SNaPshot基因分型 利用DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)提取基因组DNA，利用SNaPshot基因分型技术对样本进行多态位点分型。12设计了3对PCR引物用于扩增3个位点的片段，设计了3个紧邻SNP位点的延伸引物用于单碱基延伸。引物采用在线Primer3软件设计(http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3＿www.cgi)(表2)。PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，PCR产物经虾碱酶(SAP)(Promega)和外切酶I(EXO I) (Epicentre)纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶(SAP)纯化后在ABI3130xl上样，SNP分型用GeneMapper 4.0(Appliedbiosystems)来分析。经随机选取5%的样本重新分型，验证结果，一致率为100%。

1.3 统计学方法 利用SPSS软件对全部样本的性别、年龄基本资料，进行独立样本t检验，以保证病例、对照样本完全匹配。利用SPSS 13.0软件，首先检验各群体是否符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律，接着进行χ2检验以检测各个位点与银屑病发生的关联情况，进行病例组及正常对照组间基因型、等位基因和单体型频率比较，探讨ADAM33与银屑病的相关程度。以比值比(OR)及95%可信区间(CI)表示各等位基因频率、基因型频率与疾病风险的相关性，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 3个ADAM33基因多态位点的等位基因频率和基因型频率 见表3。经χ2检验，3个多态位点在病例组和对照组中的分布均符合Hardy－Weinberg平衡定律(P＞0.05)。以OR值和95%CI表示ADAM33 rs2787094、rs512625和rs597980各种基因型与银屑病之间的相关性。rs2787094C等位基因频率在病例组中明显高于对照组(分别为46.3%、34.9%，P＜0.001)。rs2787094GG基因型作为参照，CC基因型和CG基因型在病例组和对照组的比较中，有明显的差异，是银屑病的高危因素[CC:OR，1.6047(1.2592～2.0450)，P＜0.0001；CG:OR，1.3130(1.1384～1.5143)，P＝0.0002]。

对于rs512625，A等位基因在对照组中明显高于病例组(分别为41.6%、36%，P＝0.022)，AA基因型在对照组中的频率高于病例组，这表明AA基因型可能是保护因素[OR:0.7890(0.6556～0.9495)，P＜0.0164]。然而，rs597980位点在病例组和对照组中等位基因和基因型的频率无显著差异，它们与银屑病可能无相关性。

2.2 rs2787094与银屑病临床表型的相关性 分析rs2787094的基因型和等位基因在各临床表型分组中分布频率的差异性(表4、5)。rs2787094CC基因型的频率在晚期发病组明显高于对照组(P＜0.05)和早期发病组(P＜0.05)，在早期发病组和对照组间无差异(P＝3.144)。rs2787094C等位基因得到同样结果，表明rs2787094CC基因型和rs2787094C等位基因与晚期发病具有相关性。

rs2787094CC基因型频率在严重组高于对照组(Pc＜0.05)，同时对照组高于轻型组(Pc＜0.05)，但在严重组和轻型组之间无差异(Pc＝0.252)。rs2787094C等位基因在轻型组频率高于对照组(Pc＜0.05)，在轻型组和严重组之间无差异(Pc＝0.78)，在严重组和对照组间无差异(Pc＝0.786)。因此认为rs2787094CC基因型、rs2787094C等位基因与皮损严重程度无相关性。

rs2787094CC基因型和C等位基因频率在无家族史组明显高于对照组(Pc＜0.05)和有家族史组(Pc＜0.05)，而在有家族史组和对照组之间无差异(分别Pc＝5.616和Pc＝2.85)，因此rs2787094CC基因型和C等位基因与无家族史患者具有相关性。

在性别分组中，rs2787094CC基因型和C等位基因频率在男性患者和女性患者之间无明显差异(分别为Pc＝4.236和Pc＝0.714)，因此认为rs2787094CC基因型和C等位基因与性别无相关性。

2.3 单体型与东北人群银屑病的关联分析 连锁分析发现，3个多态位点无连锁不平衡性，由此，3个多态位点均用于构建单体型，以便寻找与东北汉族人群银屑病相关的单体型。表6列出了所有构建的单体型。针对单体型与银屑病的相关性进行分析，结果显示ADAM33的单体型与银屑病具有相关性，在8个单体型中，H3和H5单体型在病例组中频率高于对照组，表明H3和H5单体型可能与东北汉族的银屑病具有相关性[H3:OR，1.512(1.137～2.011)，P＝0.004；H5:OR，3.837(2.656～5.543)，P＜0.001]。另外，H1、H4和H7单体型在病例组的频率低于对照组，可能是保护性因素[H1:OR，0.711(0.563～0.900)，P＝0.004；H4:OR，0.621(0.462～0.836)，P＝0.002；H7:OR，0.569(0.382～0.849)，P＝0.005]。然而，其它单体型(H2，H6和H8)在病例组和对照组中频率无显著差异(P＞0.05)，提示与东北汉族的银屑病无相关性。

表2 基因分型引物

表3 病例组和对照组中3个ADAM33基因多态位点的等位基因频率和基因型频率

表4 rs2787094CC基因型在不同临床表型组间及与对照组之间的频率比较

表5 rs2787094C等位基因在不同临床表型组间及与对照组间的频率比较

表6 ADAM33单体型在病例和对照中的分布及其与银屑病的相关性

3 讨论

本研究对400例北方银屑病患者和398名正常对照的ADAM33基因中的3个位点多态性进行检测，结果证实ADAM33基因的多态性可能与东北汉族银屑病的发病有关，在银屑病的易感性方面发挥重要作用。

3个被检测的SNPs位于基因的3’端附近，此处为ADAM33基因调节信号的序列区域，因此这些SNPs可能影响转录的效率或者转录稳定性。6其中rs2787094位于3’UTR的第22外显子中，可能参与mRNA的定位和加工以及蛋白质的成熟，因此rs2787094可能影响基因的调节功能；rs512625位于3’侧翼，因此这些多态位点可能与真正的影响信号传导的多态位点存在连锁不平衡关系，潜在的影响ADAM33的功能，以此参与银屑病的发病机制。9

在法国家族性样本中ADAM33基因中的四个多态位点(rs512625，rs677044，rs597980和rs44707)首次证实与银屑病具有相关性，表明ADAM33基因是银屑病的候选易感基因。1该结果在另外一个法国人群研究中得到验证:rs512625与银屑病具有相关性，rs628977与银屑病的早期发病相关联；2此外，在对北美的人群研究中发现rs597980与银屑病具有明显的相关性，进一步支持了ADAM33是银屑病的易感基因的可能性；3在中国南方小样本的人群研究中发现rs2787094与银屑病有相关性。4虽然不同种族的人群遗传背景存在很大差异，但在不同种族的人群中均证实了ADAM33基因与银屑病存在相关性，这提示ADAM33基因作为银屑病易感基因，在银屑病的发生过程中发挥了重要作用。

在本研究中发现的与银屑病具有明显相关性的两个多态位点(rs2787094和rs512625)与以往文献报道的结果不尽相同。例如，在法国家族性研究和人群研究以及本次中国人群研究中，rs512625被证实与银屑病具有相关性的多态位点，1但在北美的人群研究中，并未发现这种相关性。3另外，rs2787094在本研究的东北人群和南方的人群研究中均显示与银屑病有相关性，4但在法国家族研究中却无相关性。1由此可见，在每个研究中都有明显相关的多态位点，但每个研究结果不尽相同，在基因多态性研究中，这种不一致性是很普遍的。12－14这种偏差可能有几种原因:首先，真正的ADAM33基因功能改变的相关突变还没有被发现，或者和已发现的突变标记多态位点具有连锁不平衡；其次，银屑病遗传异质性可能导致种族之间差异；再者，在不同的种族之间可能存在不同的连锁不平衡；最后，临床异质性也有可能影响即定的关联研究。

在既往的基因型和表型相关性的研究中，只有在亚组和对照组之间，或者在各亚组之间进行比较。然而，本研究同时进行亚组和对照组之间以及各亚组之间进行比较，避免了假阳性结果。我们选取在中国南方和北方两个人群中均与银屑病相关的ADAM33基因位点rs2787094进行基因型和表型的分析发现，在发病年龄亚组中，数据显示rs2787094CC基因型和C等位基因与晚期发病有关，在有无家族史亚组中，显示与散发患者具有相关性，这与以往报道的早期发病患者多伴有家族史的临床特征相一致。15－17而且，进一步支持基因多态性在银屑病遗传因素中的作用，以及多态位点与临床表型的相关性。

构建单体型是疾病关联分析中的重要方法之一。由于所有检测的多态位点之间不具有连锁不平衡性，因此，我们构建了单体型，通过检测单体型在病例组和对照组的分布，以进一步分析ADAM33基因多态性在银屑病的发病机制中的作用。研究结果发现，H3和H5单体型为银屑病危险因素，而H1、H4和H7单体型是保护性因素。由此，单体型可能携带针对银屑病的真正的未知病因性变异区域的重要的信息。

综上所述，本研究表明ADAM33基因多态性和东北汉族银屑病具有相关性，为银屑病的诊疗方案提供新的信息。今后，将在各种族大样本的人群中，进一步进行ADAM33其它位点的关联和深入的功能研究，以阐明ADAM33基因在银屑病发病中的作用机制。

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(收稿:2013－12－04 修回:2014－01－28)

Association of ADAM 33 gene polymorphism and psoriasis in Northeastern Chinese Han population

ZHOU Jing，XU Peng，YANG Bo，et al.Department ofDermatology，The Second Affiliated Hospital ofHarbin Medical University，Harbin，150081

Objective:To determine the association between ADAM33 and psoriasis in the northeastern Han population.Methods:Three common single nucleotide polymorphisms(SNPs)(rs2787094，rs512625 and rs597980)from ADAM33 were genotyped in 400 patients with psoriasis and 398 controls from the northeastern Han population using a Multiplex SNaPSHOTmethod.SNPs genotypes and alleles frequencieswere analyzed by SPSS 13.0.Rs2787094 CC genotype and C allelewere compared between the patients and controls，aswell as between patientswith different clinicalphenotypes of psoriasis.Results:The rs2787094CCCG genotypes(P＜0.05)and 2 haplotypeswere associated with an increased risk of psoriasis(H3，H5；P＜0.05). The rs512625AA genotype and 3 haplotypes(H1，H4，H7)were found to be a protective factor against psoriasis(P＜0.05).Rs2787094CC genotype and C allele were associated with patients both in the late onset group and/or in the sporadic group(P＜0.05).Conclusion:ADAM33 is associated with psoriasis in the northeastern Han population.

psoriasis；ADAM33；SNP

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(编号:12511178)

哈尔滨医科大学附属第二医院皮肤科，150081