单克隆抗体在黑素瘤诊断中的作用

热依拉·莫合塔尔综述，康晓静审校

（1.新疆医科大学新疆乌鲁木齐830054；2.新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科新疆乌鲁木齐830001）

单克隆抗体在黑素瘤诊断中的作用

PNL2 monoclonal antibodies in the diagnosis of melanoma

热依拉·莫合塔尔1综述，康晓静2审校

（1.新疆医科大学新疆乌鲁木齐830054；2.新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科新疆乌鲁木齐830001）

恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是原发于皮肤的高度恶性肿瘤，是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一，所以早期诊断和及时治疗显得尤为重要[1]。肿瘤标记物可由肿瘤细胞产生或由非肿瘤细胞，如与肿瘤有关的免疫系统产生，可存在于细胞内或细胞表面[2]。因血清肿瘤标记物的检测简便易行,所以在肿瘤学中的应用日益广泛，但在黑色素瘤中大多数血清肿瘤标记物的敏感性和特异性均不高，且大多数在疾病晚期才高表达，因而不适于早期和亚临床期[3]。新的黑素瘤生物标记物的发现及其临床应用价值的研究具有重要意义，可为黑色素细胞瘤建立一种更加准确的具有治疗意义的肿瘤分期和分类方法[4]。

1 免疫组织化学在黑素瘤诊断中的作用

1.1 黑素瘤诊断中存在的问题及解决方案：尽管大多数黑素瘤通过临床表现、组织病理检查即可诊断，但仍然有部分的原发黑素瘤和转移性恶性黑素瘤难以诊断及识别其组织来源，需要借助免疫组织化学帮助诊断。抗黑素瘤相关抗原单克隆抗体因此成为辅助诊断恶性黑素瘤的有力工具，即便是以无色素性黑素瘤为表型的黑素瘤也不例外。

1.2 抗黑素瘤相关抗原抗体在诊断黑素瘤中的作用：S-100蛋白（S100 proteins，S-100）是一种钙结合蛋白，抗S-100蛋白抗体对黑素细胞和黑素瘤染色灵敏性高，但特异性不高，人类黑色素瘤-45（Human Melanoma Black-45，HMB-45）识别黑素小体特异性糖蛋白GP100对黑素细胞有很高的特异性[5]。但其应用受染色异质性和灵敏性较S-100差的限制，且假阴性率高达35%，黑素A (MelanA)/黑素瘤抗原-1(melanoma antigen recognized by T-cells 1,MART-1)和酪氨酸酶(Tyrosinase)在转移性黑素瘤中也有10%～15%不表达相反，敏感的标记物小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscription factor,MITF)，存在许多亚型并在其他组织中表达，因此，阳性结果不一定反映黑素瘤。故此,不能单独应用某一种抗体诊断黑素瘤。所以,到目前为止还没有在灵敏性和特异性上都令人满意的抗体[6-7]。

2 PNL2的基本性质

2.1 PNL2的性质:Rochaix等[8]于2003年首次提出PNL2可作为黑素瘤细胞标志物。接着Kurotaki等[9-10]证实PNL2蛋白对人类和白化鼠黑素瘤具有诊断价值,可PNL2蛋白的基因组研究、确切作用机制及过程尚未发现。

2.2 PNL2单克隆抗体的制备:Rochaix等[8]指出PNL2单克隆抗体的制备，是在BALB/C（人源化小鼠的代号）小鼠腹膜内注射耦合类人生长抑素受体2与谷胱甘肽S-转移酶C末端部分的重组蛋白后，经过一段时间免疫克隆产生的抗体。非免疫球蛋白产生的骨髓瘤细胞系P3×63 Ag8-653也作为配偶体，经过标准技术参与PNL2单克隆抗体的产生。并通过人胰腺和扁桃体的冰冻切片的ELISA活性和间接免疫过氧化物酶方法的聚链反应测试出上清液中的抗体。最后根据制造商的协议使用同系小鼠单克隆抗体分型试剂盒进行同种型抗体鉴定。

3 PNL2在黑素瘤诊断中的作用

3.1 不同物种的PNL2蛋白与黑素瘤的关系：Kurotaki等[9]研究表明，PNL2可作为诊断人类、小鼠和白化鼠黑素瘤的标志物，得出PNL2是最近产生的单克隆抗体（mAb）识别正常和肿瘤黑素细胞，但PNL2识别的抗原目前仍未发现。Giudice等[11]首次采用PNL2来检测犬黑素细胞抗原。通过对PNL2在犬黑素瘤免疫反应进行测试（4例犬的原发性黑素瘤，2例为口腔黑素瘤，2例为甲床黑素瘤），并与Melan A进行比较。并采用正常的犬组织和非黑素瘤作为阴性对照，对犬黑素瘤的冷冻样品进行福尔马林固定、石蜡包埋后通过Western blot分析黑素细胞与PNL2和Melan A免疫反应性。Western blot检测证实犬黑素瘤中PNL2抗体蛋白的存在。PNL2免疫组化染色的犬黑素瘤细胞胞浆内出现颗粒状花纹。在所测试的黑素细胞肿瘤，PNL2阳性率为62.0%，Melan A为59.0%；两种单克隆抗体染色皆阳性50.7%。这两种抗体染色至少有一种抗体阳性的例数占68.0%。使用PNL2染色显色范围比Melan A更大。类似人类粒细胞，犬粒细胞的黑素瘤的PNL2染色分别采用Western blot和免疫组化分析均为阴性。可见，PNL2单抗在福尔马林固定的犬黑素细胞肿瘤的识别中仍然是一个有价值的诊断试剂。犬和人类黑素瘤中提取物与PNL2的免疫染色显示类似的结果，这表明人和犬这两个不同的物种的黑素细胞中存在能与PNL2反应的相同蛋白质。人的粒细胞也能与PNL2反应，其结果是与以往Rochaix等[8]发表的结论一致，但狗粒细胞却没有参与PNL2单克隆抗体交叉反应。这研究表明在狗中分布着与人不同的PNL2蛋白质。

3.2 PNL2与原发性黑素瘤和特殊非黑素瘤：Rochaix等[8]首次提出PNL2是一种新的单克隆抗体、主要针对抗黑素细胞抗原。他们研究发现,PNL2免疫染色标记广泛应用于正常或恶性人类组织和各种黑素细胞病变范围的分析，有很高的特异性。给予皮肤和口腔黏膜黑素细胞的细胞质和粒细胞染色时，PNL2显示高浓度。在不同的痣组织学类型,如：皮内痣、表皮痣和混合痣，PNL2染色大多数都是阴性，只有散在分布的痣细胞在其真皮乳头层才能被标记。标记原发黑素瘤时，不管黑素瘤的组织学类型分型如何，PNL2的阳性率都在70%以上。Busam等[12]分析PNL2在各种正常组织、黑素细胞痣、原发黑素瘤以及非黑素瘤，包括黑素瘤的组织学类癌以及血管肌脂瘤，并检测不同的肿瘤类型派生的多种细胞系的免疫反应性。他们采用传统的石蜡组织切片和几种组织微阵列板,检测PNL2、Melan A/MART-1(A103)、Tyrosinase(T311)、HMB-45（GP100）和MITF（D5）在黑素瘤中的免疫反应。PNL2阳性染色出现在正常黑素细胞、嗜中性粒细胞及黑素细胞病变良性痣以及原发性恶性黑素瘤尤其是上皮样的变体，均常用免疫阳性，但不包括其他正常的细胞类型。除了血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和恶性异型外周神经鞘瘤（属于恶性Triton肿瘤）这三种非黑素瘤的PNL2的免疫染色阳性，其余非黑素瘤均为阴性。因此，他们都得出PNL2可作为黑素瘤诊断的补充试剂。

Rochaix等[8]还发现同抗Melan A和HMB-45抗体一样，PNL2能染色标记大部分透明细胞肉瘤细胞，还有一些血管平滑肌脂肪瘤和淋巴管平滑肌瘤细胞。非黑素细胞病变不能被标记。蛋白质组化途径表明，免疫亲和纯化PNL2结合复合体可以从黑素瘤细胞系中分离出来，黑素瘤细胞系包括TAP1、网格蛋白17和前白蛋白等蛋白质，但不包括能被HMB-45识别标记的GP100。可见，PNL2作为新的单克隆抗体，专门针对黑素细胞相关抗原。即使黑色素被漂白或脱钙后染色，PNL2仍能识别出黑素细胞相关抗原。PNL2染色标记模式和HMB-45相似，与Melan A和GP100不同。另外，Nonaka等[13]在35例含有大量坏死恶性黑素瘤的病灶的研究中指出，S-100作为最敏感的标记物（灵敏度高达97%），但坏死区域表现出非特异性染色，HMB-45、Melan A、Tyrosinase、PNL2的免疫染色阳性率分别为71%、80%、86%、66%，PNL2需联合HMB-45和Tyrosinase，灵敏度才可增加至80%，提高免疫标记物诊断黑素瘤的价值。

3.3 PNL2与转移性黑素瘤：Rochaix等[8]证实PNL2能标记所有转移性黑素瘤，但标记细胞显示阳性的概率有时低于原发黑素瘤。Busam等[12]则得出相比A103、HMB45、T311及D5检测转移性黑素瘤灵敏度分别为82%、76%、92%和84%；PNL2检测转移性黑素瘤灵敏度较高为87%。且联用五种试剂在检测转移性黑素瘤时免疫阴性的病例将会明显减少。Aung等[14]在大量转移性恶性黑素瘤(214例)、结缔组织增生性黑素瘤(34例)、胃肠道黏膜黑素瘤(54例)、良性色素痣(27例)、透明细胞肉瘤(16例)和非黑色素肿瘤(1218例)进行免疫组化研究发现，PNL2在转移性黑素瘤表达为89.2%，另外，在7例S-100阴性表达的转移性黑素瘤中，PNL2有6例表达阳性。在黏膜黑素瘤中，PNL2阳性率为89%(48/54)，PNL2结缔组织增生性黑素瘤的敏感阳性率仅为6%(2/34)。可见，PNL2可作为转移性黑素瘤诊断的补充标记物。

3.4 PNL2与结缔组织增生性黑素瘤：Rochaix等[8]得出PNL2不能标记结缔组织增生性黑素瘤。Busam等[12]则得出仅1/13结缔组织增生性黑素瘤的PNL2免疫染色阳性。Aung等[14]发现KBA62在结缔组织增生性黑素瘤的敏感指标为82%（34例中28例阳性），可见，KBA62在诊断结缔组织增生性黑素瘤时可替代PNL2，以提高灵敏度。

3.5 PNL2与黏膜黑色素瘤：Aung等[14]的研究发现在黏膜黑素瘤中，PNL2阳性率很高，可替代阴性率较高的S-100、KBA62等免疫标记物。由于位于头部和颈部的黏膜黑素瘤的组织学诊断较为困难，且免疫组化染色在皮肤病变的染色标记结果并不可靠。Morris等[10]首次采用PNL2染色标记9例均起源于鼻腔鼻窦黏膜黑素瘤（福尔马林固定）的试验结果显示，4例弥漫性阳性染色中PNL2阳性率为77.8%，HMB-45为77.8%，Melan A为50%，S-100为87.5%和MITF为40%。另外3例PNL2染色优于Melan A和MITF。类比HMB-45对黏膜黑素瘤的高灵敏度，PNL2对黏膜黑素瘤的灵感度较高，优于Melan A和MITF，且特异性优于S-100。因此，Morris等[10]提出PNL2可作为头颈部黏膜黑素瘤诊断的重要辅助指标。

免疫组化是一种广泛用于日常病理诊断试验的检测技术，具有精确、快速、低费用的特点[15]。PNL2是一种研究较少的黑素瘤相关抗原单克隆抗体。PNL2对正常人皮肤黑素细胞、良性和恶性增殖的黑素细胞中染色呈强阳性，除血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和恶性异型外周神经鞘瘤这三种非黑素瘤阳性外，PNL2均为阴性。PNL2对黏膜黑素瘤的灵感度较高，但结缔组织增生性黑素瘤的灵敏度较低。鉴于其对黑素瘤普遍高特异性，更多有关PNL2蛋白以及基因组的研究应该受到人们的重视，以增加这种标记物的临床应用，并有望用于黑素瘤的靶向治疗、预后判断、指导患者用药及为黑素瘤患者提供最佳的个体化治疗方案。

[1]Ordó nezNG.Valueofmelanocytic-associated immunohistochemical markers in the diagnosis of malignant melanoma:a review and update[J].Hum Pathol，2014,45(2): 191-205.

[2]Lade-KellerJ,Riber-HansenR,GuldbergP，etal. Immunohistochemicalanalysisofmoleculardriversin melanoma identifies p16 as an independent prognostic biomarker[J].J Clin Pathol，2014，67(6):520-528.

[3]MargaritescuI,ChiriTaAD.Desmoplasticmelanomachallenges in the diagnosis and management of a rare cutaneous tumor[J].Rom J Morphol Embryol，2014，55(3): 947-952.

[4]Lade-KellerJ,Riber-HansenR,GuldbergP，etal. Immunohistochemicalanalysisofmoleculardriversin melanoma identifies p16 as an independent prognostic biomarker[J].J Clin Pathol，2014，67(6):520-528.

[5]Lukanidin E，Sleeman JP．Building the niche：the role of the S100 proteins in metastatic growth[J].Semin Cancer Biol，2012，22(3)：216-225.

[6]Ramos-VaraJA,FrankCB,DuSoldD,etal. Immunohistochemical expression of melanocytic antigen PNL2,Melan A,S100,and PGP 9.5 in equine melanocytic neoplasms[J].Vet Pathol,2014,51(1):161-166.

[7]Ivan D,Prieto VG.Use of immunohistochemistry in the diagnosis of melanocytic lesions:applications and pitfalls [J].Future Oncol，2010，6(7):1163-1175.

[8]Rochaix P,Lacroix-Triki M,Lamant L,et al.PNL2,a new monoclonal antibody directed against a fixative-resistant melanocyte antigen[J].Mod Pathol,2003，16:481-490.

[9]KurotakiT,TomonariY,KannoT,etal.Anovel immunohistochemical marker of normal and neoplastic melanocytes in formalin-fixed,paraffin-embedded tissues of albino rats[J].Vet Pathol,2008,45:383-387.

[10]Morris LG,Wen YH,Nonaka D,et al.PNL2 melanocytic marker in immunohistochemical evaluation of primary mucosal melanoma of the head and neck[J].Head Neck，2008,30:771-775.

[11]GiudiceC1,CecilianiF,RondenaM,etal. Immunohistochemical investigation of PNL2 reactivity of canine melanocytic neoplasms and comparison with Melan A[J].J Vet Diagn Invest，2010,22(3):389-394.

[12]Busam KJ,Kucukgol D,Sato E，et al.Immunohistochemical analysisofnovelmonoclonalantibodyPNL2and comparison with other melanocyte differentiation markers [J].Am J Surg Pathol，2005,29(3):400-406.

[13]Nonaka D,Laser J,Tucker R,et al.Immunohistochemical evaluation of necrotic malignant melanomas[J].Am J Clin Pathol，2007,127(5):787-791.

[14]Aung PP,Sarlomo-Rikala M,Lasota J,et al.KBA62 and PNL2:2 new melanoma markersimmunohistochemical analysis of 1563 tumors including metastatic，desmoplastic，and mucosalMelanomas and their mimics[J]．Am J Surg Pathol，2012，36(2):265-272．

[15]郭芳,康晓静.新疆地区80例恶性黑素瘤BRAF基因突变分析[J].中华皮肤科杂志，2013,46（1）：33-36.

2014-11-17

2014-12-15

编辑/李阳利

国家自然科学基金项目（81250023）；2012年度留学人员回国创业项目

康晓静，女，博士生导师；研究方向：皮肤肿瘤和遗传性皮肤病