自由探索实验在评价啮齿类动物特质焦虑情绪中的应用

肖新洋,魏 盛(综述),张惠云(审校)

(山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室，济南 250355)

焦虑是应激过程中常见的情绪反应,过度的焦虑会干扰认知功能活动[1-5],妨害个体做出适宜的判断，极大地削弱其应对能力。20世纪70年代初,Cattle等提出特质焦虑和状态焦虑的概念，随后Spielberg提出了完整的特质-状态焦虑理论，将状态焦虑描述为人们于特定情景中所产生的特定反应状态，如紧张、忧虑、恐惧等，一般持续时间较短且容易受外部刺激影响，是一种状态[6]。状态焦虑是个体在特定的情境中所产生的暂时的情绪波动状态，其特点是由紧张和忧虑所造成的一些可意识到的主观感觉，是自主神经系统的活动。它是一种复杂的、广泛性的情绪状态或反应，并且随时间的不同其强度处于不断波动变化中[7]。特质焦虑则是随时间变化相对稳定且具有个体差异的焦虑，是一种人格特质[8]。状态焦虑是特定情境引起的暂时不安状态，短暂且容易受外部刺激影响，而特质焦虑则被认为是个体持续性特征且随时间变化相对稳定[9]。

Spielberg提出的特质-状态焦虑理论对于动物也是适用的，从进化角度讲，动物所表现的防御反应是人类恐惧和焦虑反应的原始成分，动物所表现的恐惧样反应与人类的焦虑反应是相似的[10]。人类的焦虑反应主要表现为逃避现实、逃跑行为、警觉性提升，同样的行为反应也可于动物身上观察到。目前评价啮齿类动物状态焦虑的方法有很多，如高架十字迷宫[11-15]、旷场试验[6,16-18]和明暗箱[19-21]等，而用来评价特质焦虑的方法目前只有自由探索实验一种[22]。自由探索实验是一种非条件反射模型，以动物自发的恐惧样反应[23]为行为学原理，由Griebel等[22]发展而来，已被广泛应用于大鼠和小鼠等啮齿类动物焦虑行为学探索。

1 自由探索实验的实验原理与历史沿革

自由探索实验中动物被放到一个包括熟悉和陌生部分的环境中自由走动(图1)，由于动物对熟悉和陌生之间有选择性，预测特质焦虑水平不同动物会偏好不同环境[22]。自由探索实验最初由Hughes[24-25]描述，观察到Wistar大鼠通常偏好陌生环境。随后Griebel等[22]对比了两种不同品系的小鼠BALB/cA和C57BL/6，观察到BALB/cA小鼠对熟悉环境显示出显著的偏好，然而C57BL/6小鼠则对陌生环境显示出显著的偏好，揭示了自由探索实验可以区分特质焦虑，同时还有一些证据显示实验期间焦虑状态并没有改变。Misslin等[26-27]观察到Swiss大鼠除非被强制进入陌生环境否则并不会显示出恐惧的生理学迹象,即大鼠对于新环境具有恐惧样行为。Belzung等[28]于1994年分析证明自由探索实验中的测量变量和状态焦虑模型中的变量因子不同，说明自由探索实验所评价的焦虑是特质焦虑，而且自由探索实验被证明随时间变化是稳定的。

2 自由探索实验的设计

2.1器材 模型装置是根据Griebel等[22]的描述建立的，装置的尺寸是基于Hughes[24-25]的工作设计(图1)。该装置由一个木质主体箱构成，分为两个隔间，每个隔间细分为三个探索单元(30 cm ×20 cm×20 cm)，每个单元之间通过小的开口互联，两个隔间通过一个可抽拉的隔板来分离。

图1 自由探索箱构造图

2.2实验设计 为了考察同一品系大鼠自由探索实验测得焦虑样行为是否随时间变化而波动，以此证明该焦虑样行为属特质焦虑，分别进行两次实验[29]。

2.2.1实验1 用30只Wistar大鼠间隔1周进行两次自由探索实验。为使动物熟悉隔间，测试前大约24 h，装入隔板，将动物放入装置内的一个隔间，预留另一个隔间做正式测试。熟悉区用垫料覆盖底部并可以自由进食进水。测试当日，将熟悉区与陌生区间隔板抽去，暗淡红光下观察动物10 min，测定陌生区停留时间等参数。实验结束后，将大鼠放回饲养笼中。每次实验后，用10%乙醇溶液清洁自由探索箱。

2.2.2实验2 该实验过程和实验1大部分相同，不同之处是两次实验间隔周期改为4周，同时观察时间由10 min增加到15 min。

2.3数据统计

2.3.1数据分析的实验参数 陌生区停留时间百分比(陌生区停留时间/总时间×100%)，评估对区域的偏好，初测和复测采用独立样本t检验来比较，然后分别和50%进行对比。

2.3.2复测信度分析 陌生区停留时间百分数用ICC[35](组内相关系数)和Kappa[31]两种数据检验。一般认为ICC或Kappa>0.75，则认为可信度很好；处于0.5～0.75之间，则认为可信度良好，尚可接受；而<0.5，则认为可信度很差，测量方法或工具所得结果不可靠[32]。

2.4结果分析

2.4.1实验1 整个10 min的观察期间初测过程中动物并没有对陌生区表现出明显的偏好，但这种偏好在复测过程中表现得非常明显(图2)。陌生区停留时间百分数的结果显示初测和复测具有很好的一致性和较好的可信度(ICC>0.5,Kappa>0.75)。

#表示测试中在陌生区的时间百分数和50%比较，P<0.05

图2对于陌生区的偏好(实验1)

2.4.1实验2 整个15 min的观察期间初测与复测过程中，动物对于陌生区均有明显的偏好(图3)。陌生区停留时间百分数的结果显示初测和复测具有很好的一致性和较好的可信度(ICC>0.5,Kappa>0.75)。

****表示测试中在陌生区的时间百分数和50%比较，P<0.05

图3对于陌生区的偏好(实验2)

陌生区停留时间百分比反映了动物的焦虑状态，探究陌生区和熟悉区单元格总数反映动物的运动能力，陌生区探究单元格数反映了动物陌生环境内的探索行为，与焦虑程度有一定相关性。实验1和实验2结果表明，自由探索箱陌生区停留时间百分比复测信度好，即评价焦虑状态的稳定性和可靠性较好，且没有因实验时间变化而波动，这与大鼠对陌生区的偏好相吻合，提示该指标可能作为评价大鼠特质焦虑的参数。

3 问题与展望

自由探索实验虽然作为评价啮齿类动物特质焦虑情绪的可靠方法已经建立并应用，但其中也面临许多问题。

3.1自由探索实验装置自动化问题 自由探索实验主要依靠人来评分，会因为测试者之间的主观性而产生结果偏倚[33]，一个自动控制系统可以避免这些问题，电脑算法一直按照同样的方式运行，可以同时对许多器械进行评分[34]，自动化通过对空间参数的表达(如距离、速度)可以提升对运动行为的评价，但目前自由探索实验的自动化仍不成熟，亟待完善。

3.2自由探索实验的实验设计及理论验证方面的问题 不同品系大鼠自由探索实验并未进行，因此对其用于大鼠特质焦虑评价证据不足。尽管已有学者报道不同品系小鼠[23]对自由探索装置陌生区和熟悉区有不同偏好，进而佐证自由探索实验可用于检测小鼠特质焦虑程度，但未见有应用自由探索实验检测不同品系大鼠特质焦虑水平的报道。事实上这种基于大鼠不同遗传背景的特质焦虑水平差异可为自由探索实验用于评价大鼠特质焦虑提供更为充足的行为学证据。如果有足够实验数据表明不同品系大鼠对自由探索装置陌生区和熟悉区偏好程度不同，而高架十字迷宫、旷场等检测状态焦虑行为学实验结果间并无明显差异，则论证自由探索实验可用于检测大鼠特质焦虑水平无疑更具有说服力。

自由探索实验的基本原理是制造一种特定应激场景让动物遭受探索-恐惧的冲突心理体验，其基本内核与高架十字迷宫、旷场、洞板实验[35-38]等并无明显区别。众所周知，以上提及行为学实验可用于评价动物焦虑、抑郁等多种情绪，则一个明显的推论是自由探索实验可否用于评价动物其他特质情绪，如特质抑郁或特质怒？如果可用于评价其他特质情绪则各类特质情绪间又当如何区别？

特质焦虑与状态焦虑相关性如何？前文已提到特质焦虑和状态焦虑间的联系与区别，则两者相关性究竟如何也是研究者感兴趣的科学问题。从理论角度讲，这似乎不是一个问题，一般认为高特质焦虑的个体相比低特质焦虑的个体面临危险和威胁的情况时会呈现更频繁、力度更强烈的状态焦虑反应。然而，这种观点是否适用于动物模型？可以假设动物在自由探索实验中显现出高焦虑水平，在高架十字迷宫中同样会显现出高焦虑水平，那么两个模型获得的结果就会呈线性正相关，这一假说的检验也有助于研究者更好地认识特质焦虑与状态焦虑[40]的区别。

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