二维混合法在尿液沙眼衣原体和淋球菌聚合酶链反应检测中的应用

牛奇山

(铁岭卫生职业学院 1招生处， 2临床教研室，辽宁 铁岭 112000)

沙眼衣原体感染是引起非淋球性尿道炎的主要原因，其所致的泌尿生殖道感染占非淋菌性尿道炎的40%～50%[1]。美国每年约有300万青年与成人感染沙眼衣原体，我国近年来病例数也不断增加。用核酸扩增方法检测沙眼衣原体和淋球菌具有较高的灵敏度和特异度。研究发现，一维混合样本检测沙眼衣原体与单独检测的结果基本一致[2]。目前关于沙眼衣原体和淋球菌的二维混合样本的设置及准确度还没有文献进行过评估，所以本研究对尿液标本进行沙眼衣原体和淋病的二维混合法研究。

1 材料和方法

1.1一般资料 99例男性性病患者均为2012年6月至2013年1月在开远市劳教所服刑者(患者资料不宜公开)。所有患者均经病原学确诊。

1.2方法

1.2.1基本步骤 每例患者留取清晨中段尿。分别用单独检测法、一维检测法[2]和二维混合法对99份样本进行检测，检测结果与病原学检测结果进行比较，以判断结果的特异度和灵敏度；同时，记录每种方法消耗检测池的个数，以根据经济效益判断方法的可行性。

1.2.2二维混合法 将待检测样本在第一次混合的基础上再次进行交叉混合。按“9样本一组”构成待检测混合样本。如果该混合样本检测为阴性，则9份样本只需检测一次；如果该混合样本为阳性或抑制(抑制是由于尿液样本中存在聚合酶链反应抑制因子而降低其检测效率)，则按图1方式进行二维交叉混合，即将9份样本排列成3行3列的矩形(9=3×3)，然后将同行、同列的样本分别进行第二次混合。二维混合模式及结果判断方法(图1)：由图1.1和图1.2可知，如果行中仅有1行或者列中仅有1列为阳性或抑制，则根据行和列的交叉点即可直接判断出图中行列相交的阴影处样本为阳性或抑制,此时这9个样本共需要检测的次数为(1+3+3)次；如果出现阳性或抑制行和列的数目都不唯一，根据交叉法将无法直接判断出具体是哪个样本为阳性或抑制，如在图1.3中，只能判断在4个交叉点中至少有2个阳性或抑制样本，但无法判断究竟哪些样本为阳性或抑制，这时需要对这些交叉点处的样本再分别做检测，如果此时出现阳性或抑制的有a行、b列，则一共有的交叉点为a×b个，因此这9个样本共需要检测的次数为(1+3+3+a×b)次。二维混合法的检测流程见图2。抑制样本处理方法同阳性样本。

1.1 1.2 1.3

图1二维混合模式及判断方式(图中，黑色代表结果阳性；白色代表结果阴性；灰色代表无法判断)

图2 二维混合法的检测流程

1.2.3实验步骤 患者尿液标本经聚合酶链反应试剂(华远生物技术研究所)处理后，在聚合酶链反应扩增仪(伯乐G-3618型，美国)上完成扩增全过程。

1.2.4结果判读 以下前三项的该次检测结果应视为无效，并且整个实验步骤(包括样本的制备、扩增和检测)应重新进行。①阳性质量控制对照：A660(吸光度，660 nm)检测结果应>2.0。如果阳性对照A660<2.0。②阴性质量控制对照：A660检测结果应<0.2。如果阴性对照A660>0.2。③内对照：A660检测结果应>0.2。如果阴性对照A660<0.2。④样本：沙眼衣原体A660检测结果<0.2，阳性结果>0.8。如果A660检测结果在0.2和0.8之间，不能确定沙眼衣原体是否为阳性，应将处理过的样本重新作双份检测，参考双份检测数值解释结果。淋球菌A660<0.2，内对照≥0.2，样本被认为是淋球菌阴性；淋球菌A660<0.2，内对照<0.2，样本被认为是抑制，应处理另一部分的原始样本并重新做检测。若原始样本用完，必须采集新的样本。

2 结 果

2.1单独检测法检测 99份尿样的沙眼衣原体和淋球菌的阳性率分别为4.04%(4/99)和3.03%(3/99)，抑制2份。消耗检测池个数109个(表1)。

2.2一维检测法检测 沙眼衣原体和淋球菌的阳性率与单独检测一致，准确度100%。抑制样本1个，较单独检测减少1个(表2)。

表1 三种方法在尿液的衣原体淋病聚合酶链反应检测中的成本效益

2.3二维混合法检测 共检测11个检测池，其中2个检测池沙眼衣原体阳性，2个检测池淋球菌阳性，1个检测池沙眼衣原体和淋球菌均阳性，1个检测池受抑制(表1、表2)。

表2 一维检测法和二维混合法在尿液的衣原体淋病聚合酶链反应检测中的特异度、灵敏度

3 讨 论

二维混合法的检测池设置参照了李春玉等[2]的概率论模型，在阳性率为4%～8%时，采用二维混合法理论上可以最大程度地节省试剂成本。一维检测法检测沙眼衣原体/淋球菌共消耗53份检测池，较单独检测节省检测池51.38%。二维混合法检测共消耗45份检测池，较一维检测法节省检测池成本15.09%,较单独检测法节省检测池58.72%。99份样本的混合阳性率为6.06%，节省检测池成本58.72%，与李春玉等的概率论模型的成本节省57.17%[2]基本一致。可见，低阳性率时，二维混合法在其结果准确度相同的情况下，较一维检测法更大程度地节省了检测的成本。但在开始混检测池检测之前，需要根据不同人群的不同阳性率情况，设置不同的检测池，以达到最大程度的成本节省。

准确度：一维检测法和二维混合法检测结果与单独检测法结果完全一致，准确度均100%，这一点与Shipitsyna等[3]的结果相一致，并没有因为9倍稀释而降低其检测的敏感性和特异性。

抑制(内对照)情况：一维检测法和二维混合法检测出1个样本受抑制，与单独检测(2个样本受抑制)相比减少了1个[抑制率1.01%(1/99)]，这可能是由于二维混合法检测使抑制物质稀释而减少了其对样本的抑制作用，这与杨晓英[4]的结果一致。本次二维混合法检测的抑制率(1.01%)相对较低，并没有因为抑制情况而增加拆检测池的概率。如果抑制率较高，会很大程度的消耗试剂成本，因此二维混合法并不适用于抑制率较高的群体沙眼衣原体和淋球菌的筛查。

二维混合法检测增加了实验及数据的记录步骤，容易导致错误的假阳性或假阴性结果的出现。此外，二维混合法检测还会导致被混在一起的多个样本检测结果均为阳性，增加了不理想操作(如使用吸管)的使用机会，易导致交叉污染及假阳性结果的出现。因此，二维混合法检测必须严格按照操作规范实施，避免交叉污染的发生。但目前还没有权威的二维混合法检测沙眼衣原体/淋球菌的操作规范出台，国内外各实验室均按照各自的操作规范进行，因此各自的结果难免存在差异。本研究的实验材料为尿液样本，对于宫颈拭子的二维混合法的评价还有待探究。

总之，在我国性病发病率逐年上升以及性病感染状况不断复杂化的情况下[1]，提高性病实验室检测方法的敏感性、特异性，简化操作步骤、缩短检出时间，加大力度开展高危人群性病感染的筛查工作是防治性病的重要措施。传统的泌尿生殖道沙眼衣原体和淋球菌感染检测方法普遍存在检出率低、耗时长、敏感性低、特异性差的缺点，给性病的早期诊断带来困难。实时聚合酶链反应技术克服了传统方法的许多缺点，具有敏感性高、特异性高、效率高、污染小等特点，因此已在临床检测中广泛应用，但因其成本昂贵，目前很少应用于大规模的沙眼衣原体和淋球菌筛查[5]。本研究中的二维混合法聚合酶链反应检测沙眼衣原体和淋球菌的方法较一维检测法更进一步的节省了试剂成本，因此非常适合在我国这样的发展中国家的沙眼衣原体和淋球菌筛查中广泛应用。

[1] 中华人民共和国卫生部.2010年度全国法定传染病报告发病、死亡统计报告[EB/OL].北京：中华人民共和国卫生部，(2010-10-1)[20113-3-20]http://www.yzhjcdc.cn/ReadNews.asp?newsId=2243&smallclassid=.

[2] 李玉春,张茂,刘沛,等.二维混合血清法及费用效益定量评价[J].中国卫生统计,2006,23(2):137-139.

[3] Shipitsyna E,Shalepo K,Savicheva A,et al.Pooling samples:the key to sensitive,specific and cost-effective genetic diagnosis of Chlamydia trachomatis in low-resource countries[J].Acta Derm Venereol,2007,87(2):140-143.

[4] 杨晓英.荧光定量聚合酶链反应在同时检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和解脲脲原体中的应用[J].检验医学，2012,27(9):770-772.

[5] 蒋建文.沙眼衣原体研究进展[J].第四军医大学学报，2009，21(4)：2483-2485.