产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

李猛 陈利飞 杨建楼 马春玲

（齐鲁工业大学食品与生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室，济南 250000）

产β-淀粉酶菌株的筛选及β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

李猛 陈利飞 杨建楼 马春玲

（齐鲁工业大学食品与生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室，济南 250000）

从淀粉厂附近的土壤中筛选到一株能够利用淀粉的细菌，对该细菌进行生理生化检测和16S rDNA同源性比对，分析该菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。利用基因克隆技术得到了该菌株的β-淀粉酶基因，该基因含有一个约30个氨基酸的信号肽序列。将该β-淀粉酶基因重组进入质粒pET-28a中，转化进入E.coli BL21（DE3）中进行表达。检测表达结果显示得到了重组后的β-淀粉酶蛋白质，重组酶的酶活力提高了53.9%。

β-淀粉酶 蜡状革孢杆菌 克隆 表达

β-淀 粉 酶（1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2）与α-淀粉酶不同，它是一种外切型糖化酶，从淀粉的非还原性末端依次切下一个麦芽糖单位［1，2］。在小麦、甘薯、大豆和大麦等高等植物体中普遍存在β-淀粉酶，虽然细菌中大都含有α-淀粉酶，但含有β-淀粉酶的细菌并不是很多，Higashihara等［3］首次在巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）中发现了β-淀粉酶，之后研究人员又陆续发现了几种产孢子的革兰氏阳性菌也能够产生β-淀粉酶，如蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）［4，5］、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、高温放线菌（Thermeoactinomyces sp.）、热硫梭菌（Clostridium thermosulfurogenes）［6，7］和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）［8］。虽然已经发现了有些微生物能够产生β-淀粉酶，但这些细菌关于β-淀粉酶的基因数据并没有研究透彻。

β-淀粉酶的应用非常广泛，利用β-淀粉酶可进行麦芽糖的生产，麦芽糖在食品工业和医学保健方

面都具有重要用途；β-淀粉酶可促进啤酒的糖化进程，降低生产成本［9，10］；也可应用于工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域［11］。然而，目前工业生产所用的β-淀粉酶大都是利用植物提取的方法得到，价格较贵，限制了β-淀粉酶的应用，因此筛选得到一株具有β-淀粉酶基因的菌株，并将该基因克隆至适合工业化生产的宿主菌中，使其能够代替植物来源的β-淀粉酶显得尤为重要。

本研究从淀粉厂附近的土壤中，分离到一株能够利用淀粉的革兰氏阳性菌D4，并对其进行生理生化和分子生物学方面的鉴定，初步认为该菌株是一株Bacillus cereus。利用克隆技术得到该菌株的β-淀粉酶基因完整的基因序列，并将其转化入大肠杆菌中，得到β-淀粉酶的基因工程菌，对它的酶活力进行分析，旨在为得到高产β-淀粉酶的基因工程菌提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 受体菌大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）和质粒pET-28a都为本实验室保存。

1.1.2 酶和试剂 限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；核酸分子量标准和蛋白质分子量标准、EasyPfu DNA Polymerase和质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA 连接酶、Taq DNA聚合酶以及提纯和胶回收试剂盒和Ni-NTA购自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯级。引物合成和基因测序也由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 筛菌样品来源 筛菌所用土样来源于济南市长清区淀粉厂附近的土壤。

1.2 方法

1.2.1 产β-淀粉酶菌株的初筛 称取5 g土样，放入装有45 mL无菌水的三角瓶中，震荡20 min后静置5 min，从中吸取1 mL置于事先灭好菌的试管中，再加入9 mL无菌水，并进行梯度稀释至10-6待用。分别在10-4、10-5和10-6浓度下各取1 mL土壤稀释液制成混菌平板，将培养皿放入37℃ 培养箱中培养24 h。在长出的菌落上滴加碘液，挑取有明显水解圈的单菌落，进行斜面培养、保存。

1.2.2 产β-淀粉酶菌株的复筛 从斜面上取菌落接入50 mL LB培养基中，200 r/min 37℃ 培养过夜。将菌液转接到含有2%的直链淀粉的液体LB培养基中，200 r/min 37℃ 培养过夜。对培养液进行离心、过滤膜处理后，进行高效液相色谱（HPLC）分析糖成分，以含有2%的直链淀粉的LB液体培养基为对照。

1.2.3 菌落的特征观察和16S rDNA鉴定 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对得到的细菌进行菌落特征的鉴定。对得到的菌株进行培养后，利用试剂盒提取DNA。并以细菌16S rDNA通用引物为扩增引物进行PCR反应。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，循环30次；72℃补充延伸10 min。扩增完成后，对反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增结果送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对，并进行同源性分析，利用软件MEGA5.2进行发育树的构建。基于16S rDNA的高度保守性，通过测序，与基因库中已有的菌种的16S rDNA序列进行同源比对，可判断待测菌的种属类别［12］。

1.2.4 重组质粒的构建 根据已公布的β-淀粉酶基因与NCBI比对结果，设计合成上下游引物：上游，5'-CGCGGATCCATGAAAAATCAGTTTCAATATTGTTGTATTGTTGTTTTG-3'；下游，5'-CCGCTCGAGTTACCACCAACTTACATGAGAGGTAGTCTTCAT-3'。其中划线部位分别为BamH I和Xho I 酶切位点。以所得β-淀粉酶菌株D4的基因组为模板，用EasyPfu DNA Polymerase进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸3 min，循环30次；72℃补充延伸10 min。1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物及浓度。将扩增得到的目的片段进行纯化、双酶切，并与同样经过双酶切的表达载体pET-28a进行连接反应，得到重组质粒pETBA。将重组质粒pET-BA转入表达宿主E.coli BL21（DE3）中，经Kan抗性筛选、菌落PCR筛选得到克隆菌株E.coli BL21（pET-BA）。

1.2.5 重组蛋白的表达 取构建的E.coli BL21（pETBA）甘油保藏菌种500 μL接入含有50 μg/mL Kan的50 mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。菌液转接

入另一含有50 μg/mL Kan的50 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养7 h（达到菌株生长的对数中后期），添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷），25℃ 180 r/min继续培养12 h，离心收集菌体，收集到的菌体用pH7.4的1/15 mol/L磷酸盐缓冲液15 mL重悬菌体，超声破碎，超声功率300 W，间歇时间6 s，破碎时间5 s，全程时间12 min。破碎后离心收集菌体，对上清液进行浓缩并SDS-PAGE分析。

1.2.6 Ni-NTA 亲和层析 从4℃冰箱中取出保存的镍柱，重悬填料并静置使填料完全下沉到柱子的底部，将柱内酒精溶液放出。加入5-10倍柱体积的Ni-Native-0缓冲液平衡填料，控制流速1 mL/min；加入1.2.5的大肠杆菌裂解液，保持30 min，控制流速1 mL/min，收集流出液；用5-10倍柱体积的Ni-Native-50缓冲液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；用5-10倍柱体积的Ni-Native-100缓冲液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；用5-10倍柱体积的Ni-Native-250缓冲液溶解目的蛋白，控制流速1 mL/min，并收集流出液；加5-10倍柱体积的Ni-Native-0缓冲液平衡柱子，并用30%的乙醇溶液保存填料，对收集到的酶液样品进行SDS-PAGE分析。

1.2.7 糖成分分析 以2%的直链淀粉溶液为底物与所得粗酶液在50℃反应24 h，高速离心，取上清进行0.22 μm滤膜过滤，过滤后的上清液进行高效液相色谱法（HPLC）检测糖成分。

2 结果

2.1 菌株的初步筛选

从淀粉厂附近的土壤中取得5份土样，每个样品中分离到10株能够利用淀粉的菌株，都有不同程度大小的透明圈出现（图1），以得到的这50株能够产生透明圈的菌株为基础，进行复筛。

图1 菌株初筛结果

2.2 菌株复筛结果

以含有2% 直链淀粉的培养基进行发酵培养，对培养后的培养液上清液进行高效液相色谱法（HPLC）分析培养基的麦芽糖含量。结果显示大多数菌株都能够产生麦芽糖（43株菌），但其中A2、D4、E7三株菌产生的麦芽糖含量较其他菌株要高，麦芽糖含量分别为9.74，9.98和9.36 g/L三株菌培养基糖含量测定见图2，以麦芽糖含量最高者D4菌株进行进一步的鉴定。

2.3 菌落形态观察

在普通固体LB培养基上，30℃培养24 h，显微镜检测（图3），菌落形状近似圆形，白色（似蜡烛颜色），直径5-7 mm，菌落较软，表面粗糙。通过显微镜观察，该菌株呈杆状，无荚膜。

2.4 菌株的生理生化鉴定结果

根据菌体的形态观察，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定试验，结果如表1所示，菌株D4为革兰氏阳性，V-P反应呈阳性、不产生吲哚、与甲基红反应呈阴性，与葡萄糖和蔗糖反应呈阳性，与乳糖反应呈阴性，并可同时消化淀粉和糊精。

2.5 16S rDNA鉴定结果

将得到的D4菌株的16S rDNA序列进行Blast，并与同源性高的菌株利用软件MEGA5.2构建系统发育树，结果（图4）表明，目标菌株D4与Bacillus cereus strain JBE0011的遗传距离最近，同源性最高，且 D4与 Bacillus cereus strain JBE0011的 16S rDNA的同源性为99%。因此认为筛选到的D4菌株为Bacillus cereus。

2.6 β-淀粉酶基因的克隆与表达

利用所设计引物，以筛选所得菌株D4为模板进行克隆，凝胶电泳结果（图5）显示，所得β-淀

粉酶基因条带大小约为1 700 bp左右。重组质粒单酶切结果（图6）和双酶切结果（图7）都证明该基因已经克隆到质粒pET-28a中，测序结果显示该β-淀粉酶基因（包含信号肽序列）全长1 641 bp。与NCBI比对结果显示，基因同源率为99%，所编码的蛋白同源率为100%，可以确定该基因即为β-淀粉酶基因。通过SignalP-4.1对得到的β-淀粉酶序列进行分析，结果显示该β-淀粉酶可能含有一个大约30个氨基酸长度的信号肽序列。在PDB数据库中与已知的Bacillus cereus的β-淀粉酶三维结构比较发现：β-淀粉酶的催化功能结构域是一个高度保守的（β/α）8圆桶结构，酶的催化活性中心位于圆桶口［13］。该基因已经提交到NCBI数据库中，编号为：KJ801918。

图2 HPLC检测结果

图 3 菌株镜检结果

表1 生理生化鉴定结果

SDS-PAGE分析结果（图8）显示，E.coli BL21（pET-BA）与对照菌株相比，在50-60 kD之间确有蛋白质的积累，由于在目的蛋白分子量附近有两条带明显增加，因此对粗酶液进行纯化。在本研究构建的β-淀粉酶的N端含有一个由6个组氨酸组成的标签，我们利用组氨酸的咪唑基团与镍离子有高度亲和作用的原理，对β-淀粉酶进行纯化。纯化后酶液进行SDS-PAGE，结果如图9所示。利用凝胶成像仪分析后，图8和图9比对结果显示，图8中50 kD到60 kD之间的两条带中的上方条带与图9中纯化结果比较接近，两条带的大小都为56 kD，与已公

布的蜡状芽孢杆菌β-淀粉酶分子大小相似。分析出现的两条带大小相差在3 kD左右，查阅文献后认为可能是由于所克隆的蜡状芽孢杆菌β-淀粉酶基因在大肠杆菌中表达、翻译、合成的过程中被大肠杆菌自身的蛋白酶类局部降解，使该β-淀粉酶丢失了信号肽序列，导致一部分蛋白分子量变小。夏巧玉等［19］在对大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达研究中，也出现了表达的蛋白分子量变小的现象。

图4 基于D4和相关菌株的16S rDNA序列构建的系统发育树

图5 β-淀粉酶基因的扩增

图6 重组质粒的单酶切

图7 重组质粒双酶切

发酵E.coli BL21（pET-BA）所得粗酶液与2%淀粉溶液反应24 h之后，经HPLC分析结果如图10所示。E.coli BL21（pET-BA）粗酶液利用淀粉产生

麦芽糖的浓度为15.39 g/L。定义β-淀粉酶酶活力单位U：1 min利用2%的淀粉产生1 μmol产物所需的酶量为一个酶活力单位。通过反应计算出β-淀粉酶粗酶液酶活力为1 425 U，相对原始菌株而言，酶活力提高了53.9%。

图9 纯化后蛋白电泳分析结果

图 10 HPLC分析结果

3 讨论

β-淀粉酶在与底物相互作用时，会发生沃尔登转位反应（walden inversion），使α-型麦芽糖转变为β-型麦芽糖［1］。β-淀粉酶能够降解直链淀粉成麦芽糖，并且在食品行业中具有广泛的应用。展现明等［18］研究发现，β-淀粉酶的添加量对麦芽糖产率有较大影响，β-淀粉酶可与普鲁兰酶共同使用来生产结晶葡萄糖和55%-65%的高麦芽糖浆。从淀粉厂附近土壤中筛选到的菌株，经HPLC分析显示，在相同条件下，其中的A2、D4、E7这3株菌产生麦芽糖较多，浓度分别为9.74、9.98和9.36 g/L。

对产麦芽糖较多的菌株D4进行生理生化以及分子生物学鉴定。一般认为16S rDNA相似性大于99%的菌株可以判断为同一个种。通过数据库比对发现，该菌株与Bacillus cereus 的序列相似性为99%，并且在菌落形态、菌体形态和生理生化特性都与Bacillus cereus一致，确定其为Bacillus cereus。Takashi等［14］从Bacillus cereus中克隆得到了β-淀粉酶基因，并分析认为完整的β-淀粉酶基因包括一个30个氨基酸的信号肽和一个与生淀粉结合的区域，认为该淀粉酶具有消化生淀粉的能力。

克隆的菌株D4的β-淀粉酶基因序列Balst结果显示，与已公布的Bacillus cereus的β-淀粉酶基因的同源性为99%，氨基酸序列同源性为100%，并且该β-淀粉酶也同样包含一个大约由30个氨基酸组成的信号肽序列。Reinikainen［15］将淀粉酶基因克隆到含有噬菌体启动子的表达质粒中，发现有17%的酶蛋白可以分泌到细胞外。Nakajima指出，能够分泌到细胞外的淀粉酶蛋白分子中一些氨基酸可能与膜的通透性有关。王为先等［16］克隆的芽孢杆菌的β-淀粉酶基因未经过改建即可以将表达产物全部分泌到大肠杆菌细胞外。而本试验克隆的D4菌株β-淀粉酶基因也包含一段信号肽序列，Bacillus cereus与芽孢杆菌同为杆菌属，但并没有在细胞外检测到β-淀粉酶酶活。可能两种菌的信号肽序列具有较大的差异。

就目前研究发现，在各种生物体中均发现了内切型的α-淀粉酶，然而只在植物和少数细菌中发现了β-淀粉酶［17］。夏巧玉等［19］成功地将大豆耐热β-淀粉酶基因转入大肠杆菌中，并得到表达产物。杨华等［20］利用α凝集素系统首次将大麦β-淀粉酶成功展示在酿酒酵母表面，为全细胞催化剂研究与应用打下了一定基础。将真核细胞β-淀粉酶基因转入原核细胞进行表达具有一定难度，但就微生物产β-淀粉酶而言，目前已报道的微生物β-淀粉酶大多为中温型，最适反应温度为40-60℃。邹艳玲等［2］从土壤中筛选到一株高产β-淀粉酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其最适作用温度为65℃。蒙健宗等［21］认为在构建基因工程菌方面，常用的化学诱导型启动子和温控诱导型启动子均存在限制其实现工业化的缺点。改用由渗透压启动子Pro U控制的T7 RNA聚合酶（RNAP）合成的大肠杆菌宿主菌，并成功地表达了热硫梭菌Clostridium thermosulfurogenes的耐高温β-淀粉酶基因，以NaCl作为诱导剂，浓

度为0.6 mol/L，酶反应温度达到70℃。利用微生物生产β-淀粉酶相比于植物更具有优势，微生物生产过程不受季节、原料等影响，容易实现自动化生产，所产β-淀粉酶性能稳定、均一，这些都是以植物为原料进行β-淀粉酶生产所难以达到的［22］。从Bacillus cereus中克隆的β-淀粉酶基因所构建的重组菌株E.coli BL21（pET-BA）能够通过发酵法快速得到大量高活性的β-淀粉酶。

4 结论

本研究从土壤中筛选到一株具有β-淀粉酶活性的细菌D4，经过生理生化以及分子生物学鉴定，确定为Bacillus cereus。将其β-淀粉酶基因克隆，在大肠杆菌中得到表达。重组菌E.coli BL21（pET-BA）产淀粉酶酶活力相对于原始菌株提高了53.9%。

［1］张剑, 林庭龙, 秦瑛, 张开诚. β-淀粉酶研究进展［J］.中国酿造, 2009, 4：5-8.

［2］邹艳玲, 徐美娟, 等. 耐热β-淀粉酶高产菌株的筛选及其产酶条件优化［J］. 应用与环境生物学报, 2013, 19（5）：845-850.［3］Higashiara M, Ohyama K, Arai M. β-Amylase from Bacillus polumyxano［J］.Agric Biol Chem, 1979, 43：719-726.

［4］Ray RR, Jana SC, Nanda G. β-amylase from Bacillus megaterium［J］. Folia Microbiol, 1994, 39（6）：5615-5632.

［5］Lee JS, Wittchen KD, Stahi C, Strey J. Cloning expression and carbon catabolite repression of the bamM gene encoding β-amylase of Bacillus megaterium DSM319［J］. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56：205-211.

［6］Hyun HH, Zeikus JG. General biochemical characterization of thermo stable extracellular β-amylase from Clostridium thermosulfurogenes［J］. Appl Envirn Microbiol, 1985, 49（5）：1162-1167.

［7］Reddy PRM, Swamy MV, Seenayya G. Purification and characterization of thermo stable β-amylase and pullulanase from high-yielding Clostridium thermosulfruogenes SV2［J］. World J Microbiol Biotechnol, 1998, 14：89-94.

［8］张双民. 土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化［J］.土壤肥料, 2006（2）：59-61.

［9］Dicko MH, Searle-van Leeuwen MJF, Beldman G, et al. Purification and characterization of β-amylase from Curculigo pilosa［J］. Appl Microbial Biot, 1999, 52：802-805.

［10］傅金泉. 酶制剂及其在酿酒工业中应用［J］.中国酿造, 1989（6）：12-15.

［11］吴襟, 张树政. 巨大芽孢杆菌β-淀粉酶基因的克隆, 表达和酶学性质分析［J］.生 物工程学报, 2008, 24（10）：1740-1746.

［12］潘涛.一株酸性α-淀粉酶产生菌的筛选, 发酵条件及基因克隆研究［D］. 郑州：河南工业大学, 2010.

［13］Hirata A, Adachi M, Sekine A, et al. Structural and enzymatic analysis of soybean β-amylase mutants with increased pH optimum［J］. J Biol Chem, 2004, 279（8）：72987-7295.

［14］Nanmori T, Nagai M, Shimizu Y, et al. Cloning of the beta-amylase gene from Bacillus cereus and characteristic of the primary structure of the enzyme［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59（2）：623-627.

［15］Reinikainen P, Lähde M, Karp M, et al. Phage lambda PL promoter controlled α-amylase expression in Escherichia coli during fermentation［J］. Biotechnology Letters, 1988, 10（3）：149-154.

［16］王为先, 张沁, 申同健. 芽孢杆菌β-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆与表达［J］. 遗传学报, 1993.20（4）：374-380.

［17］王峥, 周蓓芸, 郑幼霞. β-淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达［J］. 生物化学与生物物理学报, 1995, 27（1）：95-99.

［18］展现明, 王念祥, 饶志明.耐热β-淀粉酶高产菌株的筛选及其产酶条件优化［J］.应用与环境生物学报, 2013, 19（3）：845-850.

［19］夏巧玉, 江均平, 朱利泉, 王小佳.大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达［J］.西南农业大学学报：自然科学版, 2006, 28（4）：553-557.

［20］杨华, 樊游, 沈微, 等.酿酒酵母表面展示β-淀粉酶及其酶学性质研究［J］.食品工业科技, 2012, 33（13）：135-138.

［21］蒙健宗, 梁莲华, 周礼芹, 等.渗透压诱导表达重组Clostridium thermosulfurogenes β-淀粉酶基因［J］.食品与发酵工业, 2011, 37（6）：6-10.

［22］黄纯建, 米运宏.耐高温微生物β-淀粉酶的制备及其酶学性质的研究［J］.中国医药生物技术, 2008, 3（5）：361-365.

（责任编辑 李楠）

The Isolation of Beta-amylase-producing Bacteria and Cloning，Expression of Beta-amylase Gene in Escherichia coli

Li Meng Chen Lifei Yang Jianlou Ma Chunling
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food & Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250000）

A bacterium which can degrade starch was isolate from the soil near the starch factory, was identified as Bacillus cereus by means of morphology and physiological-chemical characterization as well as 16S rDNA sequencing. Beta-amylase gene was cloned from the strain by PCR, and gene sequence was analyzed, which can encode a signal peptide which contains about 30 amino acids. The beta-amylase gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The results showed that recombinant bacteria can produce beta-amylase, and enzymatic activity increased by 53.9% compared with the parent.

Beta-amylase Bacillus cereus Isolate clone Expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.027

2014-05-22

山东省中青年科学家科研奖励基金项目（C010302）

李猛，男，硕士，研究方向：微生物酶技术；E-mail：limeng3530@163.com

马春玲，女，副教授，研究方向：微生物酶技术；E-mail：machunling20022@163.com