阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及I型前胶原mRNA表达的影响

李晶冰张彩萍季 江崔盘根∗

阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及I型前胶原mRNA表达的影响

李晶冰1张彩萍2季 江2崔盘根2∗

目的: 明确阿维A对系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成及I型前胶原mRNA表达的影响。方法: 原代培养系统性硬皮病(SSc)患者皮肤成纤维细胞(FB)，使用不同浓度的阿维A(10－5、10－6、10－7、10－8mol/L)作用48 h，用羟脯氨酸法测定胶原的质量浓度，RT－PCR法I型前胶原mRNA的表达。结果: 阿维A实验组FB胶原合成及I型前胶原mRNA的表达较对照组减少，且均与阿维A呈浓度依赖性关系。结论: 阿维A可能通过抑制FB I型前胶原基因的表达减少胶原合成。

系统性硬皮病； 阿维A； 成纤维细胞

系统性硬皮病(SSc)是以过量胶原在皮肤、肺、消化道等内脏器官沉积为特征的结缔组织疾病，引起皮肤和内脏器官纤维化。成纤维细胞(FB)是参与SSc纤维化、硬化的主要细胞。阿维A属第二代单芳香维A酸，有个案报道其治疗SSc有效。本文通过体外试验观察阿维A对SSc患者皮肤成纤维细胞胶原分泌和I型前胶原mRNA表达的影响，探讨其治疗SSc可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基(Gibco)；胶原酶(Calbiochem)；阿维A(重庆华邦公司)；羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Biospin RNA Simply P提取试剂盒(BioFlux)；逆转录试剂盒(BioFlux)；I型前胶原特异性引物(上海生工)；小牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 FB的来源及培养 采用原代分散细胞培养法。13例SSc患者(符合美国风湿病学会1980年分类标准)，男1例，女2例，病程分别为9个月、1年、2年，Rodnan评分2分别为12、15、26。局麻下切取3例SSc患者前臂外侧活动性硬化皮损边缘皮肤组织，置胶原酶溶液中，37℃消化4 h，分离表、真皮。将分离的真皮剪碎，放入胶原酶溶液中消化分散FB，将其过滤、离心、洗涤后，加入含10%小牛血清，100 U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM培养基进行原代培养。待梭形成纤维细胞布满瓶底时，以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液消化细胞并传代增殖。实验选用第4～8代细胞。

1.2.2 阿维A对FB胶原合成的抑制作用 羟脯氨酸是胶原蛋白中一种重要且含量稳定的氨基酸，通过测定羟脯氨酸含量计算胶原的质量浓度。

将FB按4×104/孔密度接种24孔板。接种24 h后按下列浓度加入阿维A:10－5、10－6、10－7、10－8mol/ L。不含药物的培养基作为空白对照。每种药物浓度做3个平行孔。加药后48 h，从每个孔各吸取1 mL培养基上清液，按羟脯氨酸检测试剂盒说明书方法测定培养基中羟脯氨酸含量。在酶标仪540 nm处检测A值，样品中羟脯氨酸质量浓度(μg/mL)＝测定管A值×标准液浓度/标准液A值；样品中胶原的质量浓度(μg/mL)＝样品羟脯氨酸浓度×7.46(羟脯氨酸换算为胶原时的计算常数)。

1.2.3 阿维A对SSc Fb的I型前胶原mRNA表达的影响 取对数生长期的SSc Fb接种至50 m L培养瓶，每瓶细胞数1×106个。加入浓度分别为10－5、10－6、10－7、10－8mol/L的阿维A，以不加阿维A组作为空白对照。24 h后弃去培养基，收集细胞，用氯仿、异丙醇抽提细胞总RNA，逆转录得到DNA模板，进行PCR扩增，扩增参数为:预变性94℃6 min－94℃1 min－55℃2 min－72℃2 min(35个循环)－72℃5 min，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，同时加DNA Marker作为分子量对照，紫外透射仪下观察并拍照。I型前胶原:上游引物，5'ctg gtc cca agg gta aca g3'，下游引物，5'gcc agg aga acc acg ttc3'，总长285 bp。内参照(β－actin):上游引物，5'gca ttg ctg aca gga tgc ag3'，下游引物，5'cct gct tgc tga tcc aca tc3'，总长159 bp。用紫外分光光度计测定各电泳条带A值。计算I型前胶原与β－actin光密度的比值，即为其相对光密度值。

1.2.4 统计学方法 数据均采用SPSS 11.5统计分析软件包进行分析。结果以¯x±s表示，采用t检验分析，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 阿维A对FB胶原合成的影响 与空白对照组相比，阿维A对SSc患者Fb胶原合成有抑制作用，随着药物浓度增高，抑制作用增强，呈剂量依赖关系。阿维A浓度在10－5mol/L时，其抑制作用最强。(表1)

表1 阿维A对SSc Fb羟脯氨酸和胶原蛋白合成的影响

2.2 阿维A对SSc Fb I型前胶原mRNA表达的影响

不同浓度药物组及对照组SSc Fb的I型前胶原mRNA光密度值/β－actinmRNA光密度值(表2)。与空白对照组相比，10－5、10－6mol/L阿维A组I型前胶原mRNA表达下降(P＜0.05)。(表2、图1)

3 讨论

SSc是以皮肤硬化为主要临床特征，累及多个内脏器官纤维化的结缔组织疾病，其病因尚不完全清楚。FB合成和维持细胞外基质平衡的功能发生障碍，是疾病发生、发展的重要原因。通过干预异常的FB生物功能来治疗SSc，可能为该病的治疗开辟新的途径。维A酸类药物对正常人体皮肤成纤维细胞及瘢痕疙瘩、硬皮病等病理状态下异常增殖的成纤维细胞均有调节作用。阿维A酸属第二代单芳香维A酸，临床研究表明，此药物治疗硬皮病有效。3

表2 阿维A对SSc Fb I型前胶原mRNA表达的影响

图1 阿维A对SSc Fb的I型前胶原mRNA表达的影响

羟脯氨酸是胶原蛋白中一种重要且含量稳定的氨基酸，在其他组织中含量甚微，因此，测量羟脯氨酸的含量是检测胶原含量的可靠方法。本研究发现阿维A对Fb培养基中可溶性胶原的产生具有显著抑制作用。与对照组相比，10－8～10－5mol/L阿维A对SSc Fb胶原合成均有抑制作用，随着药物浓度的增高，抑制作用增强，呈剂量依赖关系。Ohtsuka等4使用放射性3H标记的脯氨酸方法测定RA对SSc Fb胶原表达的影响，结果表明，全反式维A酸在10－6、10－5mol/L的浓度可分别抑制胶原合成达34%、49%，呈浓度依赖关系。13－顺维A酸也有类似作用。这与我们的结果相类似。

SSc Fb主要合成I、III型前胶原，且I、III型前胶原比例较正常Fb增高，表明本病以I型前胶原增多为主。5Hitraya等6通过Northern杂交实验证实SSc Fb的I型前胶原ɑ链基因转录活性增强，mRNA的表达较正常对照组增高2倍以上，使用药物干预后选择I型前胶原基因进行检测，可反映阿维A对SSc Fb胶原基因转录的影响。本研究发现10－6和10－5mol/L阿维A可以显著抑制SSc Fb I型前胶原基因mRNA表达(P＜0.05)，因此可减少I型胶原蛋白在组织器官的过度沉积，减轻纤维化程度。10－6mol/L为口服阿维A可以达到的有效血药浓度，7进一步为其治疗SSc提供了依据。

1薛庆善.体外培养的原理与技术.北京:科学出版社，2001.442－444.

2Brennan P，Silman A，Black C，et al.Reliability of skin involvementmeasures in scleroderma.The UK scleroderma study group.Br JRheumatol，1992，31(7):457－460.

3 Varani J，Fisher GJ，Kang S.Molecularmechanisms of intrinsic skin aging and retinoid－induced repair and reversal.J Investig Dermatol Symp Proc，1998，3(1):57－60.

4Ohtsuka T，Koibuchi N，Sakai H，et al.Simultaneous analysis of[3H]－thymidine uptake and alpha 1(I)procollagen mRNA expression in systemic sclerosis skin fibroblasts－an in situ hybridization study.Arch Dermatol Res，2000，292(5):248－255.

5Ohta A，Uitto J.Procollagen gene expression by scleroderma fibroblasts in culture.Inhibition of collagen production and reduction of pro alpha 1(I)and pro alpha 1(III)collagenmessenger RNA steady－state levels by retinoids.Arthritis Rheum，1987，30 (4):404－411.

6Hitraya EG，Jimenez SA.Transcriptional activation of the alpha 1(I)procollagen gene in systemic sclerosis dermal fibroblasts. Role of intronic sequences.Arthritis Rheum，1996，39(8):1347－1354.

7 Brindley CJ.Overview of recent clinical pharmacokinetic studies with acitretin.JDermatol，1989，178(2):79－87.

(收稿:2013－09－02 修回:2014－01－09)

Effect of acitretin on collagen synthesis and mRNA expression in cultured system ic sclerosis fibroblasts

LIJing-bing，ZHANGCai-ping，JIJiang，et al.Xuzhou Centrol Hospital，Xuzhou，221009

Objective:To determine the effect of acitretin on the collagen synthesis and themRNA expression of proα1(I)collagen in cultured systemic sclerosis fibroblasts(SSCFB).Methods:SSCFB were incubated with acitretin(10－5、10－6、10－7、10－8mol/L)for 48 hours.Hydroproline and RT－PCR were used tomeasure the content of collagen and themRNA expression of proα1(I)collagen.Results:The content of collagen and themRNA expression of proα1(I)collagen were lower than in acitretin group than in the control group，which were in a concentration－dependentmanner.Conclusion:Collagen synthesis can be inhibited by acitretin through suppressing proα1(I)collagenmRNA expression of SSc Fb.

systemic scleroderma；acitretin；fibroblasts

1江苏省徐州市中心医院皮肤科，221009

2中国医学科学院皮肤病研究所，江苏南京，210042

∗通信作者