溶瘤腺病毒介导IL－24增强黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的研究

孙 超蒋 冠魏志平郑骏年刘彦群∗

溶瘤腺病毒介导IL－24增强黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的研究

孙 超1蒋 冠1魏志平1郑骏年2刘彦群1∗

目的: 研究溶瘤腺病毒介导IL－24(ZD55－IL－24)对黑素瘤细胞MV3放疗敏感性的影响。方法: 将对数生长的MV3细胞分为ZD55－IL－24联合放疗组、ZD55－IL－24组、放疗组、PBS对照组。应用免疫细胞化学法检测黑素瘤MV3细胞中Bax和Bcl－2凋亡相关蛋白的表达；应用Western blot法检测E1A蛋白及Bax、Bcl－2、Caspase－3凋亡相关蛋白的表达。结果: 免疫细胞化学法检测联合治疗组Bax染色强度最大，Bcl－2染色强度最小。ZD55－IL－24联合放疗作用的MV3细胞高效表达E1A，较其它组Bax的表达量增加，Bcl－2的表达量降低，Caspase－3活化更明显。结论: ZD55－IL－24联合放疗有明显的协同杀伤黑素瘤细胞的作用。

腺病毒科； 放疗； 黑素瘤； 凋亡

恶性黑素瘤仅占皮肤癌的3%～5%，然而却占皮肤癌死亡者的75%。1预后不良除与黑素瘤高浸润能力直接相关外，也与其对化疗、放疗及免疫治疗敏感性较低，易产生治疗耐受有关。2溶瘤腺病毒是治疗肿瘤的新技术，它具有高的感染效率，不但能直接杀伤肿瘤细胞，而且能在肿瘤细胞中高效表达治疗基因。3这类病毒具备良好的肿瘤靶向性，同时克服了复制缺陷型腺病毒载体转染效率低和治疗基因表达量低的难题。4本研究采用介导IL－24基因的溶瘤腺病毒ZD55－IL－24联合放疗协同杀伤黑素瘤细胞，为进一步应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 介导IL－24基因的溶瘤腺病毒(ZD55－IL－24)由中国科学院上海生命科学院刘新垣院士惠赠，病毒滴度调整为3.5×1010PFU/mL，－80℃冰箱中备用。黑素瘤MV3细胞株购自南京凯基公司。兔抗人E1A一抗(美国Santa Cruz公司)。兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl－2一抗、兔抗人Caspase－3一抗(美国Cell Signaling公司)。

1.2 细胞培养 MV3细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2条件下培养。

1.3 实验分组及治疗干预 取对数生长的MV3细胞，制备单细胞悬液，计数后铺板。培养24 h后，分为如下4组进行治疗干预:ZD55－IL－24联合放疗组、ZD55－IL－24组、放疗组、PBS对照组。联合治疗干预过程为:将ZD55－IL－24转染MV3细胞，同时将处于对数生长期细胞的培养瓶倒置于治疗床面，采用放疗仪器美国瓦里安公司产品Varian 23EX型直线加速器进行照射。

1.4 免疫细胞化学法测定线粒体途径凋亡蛋白表达将MV3细胞用4%的中性甲醛溶液固定30 min。PBS洗5 min×3次。滴加1%Triton100作用5 min。滴加血清进行封闭，37℃孵育15 min。吸去血清，分别滴加抗Bax和Bcl－2的第一抗体，4℃冰箱过夜。滴加生物素化的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS缓冲液洗5 min×3次。滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min。DAB镜下显色，结果拍照。

1.5 Western blot检测E1A蛋白及凋亡相关蛋白的表达 收集干预48 h后的MV3细胞，快速制备法提取总蛋白，经电泳、转膜后杂交，一抗为兔抗人单抗，二抗为碱性磷酸酶偶联羊抗兔多抗，以NBT/BCIP显色，结果拍照。

1.6 统计学方法 计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，假设检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 免疫细胞化学法对线粒体途径凋亡蛋白表达的测定 IPP图像分析软件计算累积吸光度(IOD)值；免疫细胞化学法观察各组Bax蛋白、Bcl－2蛋白表达，各组Bax蛋白染色强度由小到大各组依次为:PBS对照组、放疗组、ZD55－IL－24组、联合治疗组。各组Bcl－2蛋白表达染色强度由大到小各组依次为:PBS对照组、放疗组、ZD55－IL－24组、联合治疗组(图1、2)。

图1 免疫细胞化学检测各组Bax、Bcl－2蛋白表达(×400)

图2 Bax和Bcl－2蛋白在不同处理组中的吸光度(IOD)比值

2.2 E1A蛋白及线粒体途径凋亡蛋白表达的情况干预细胞48 h后，收集细胞，Western blot检测IL－24、E1A蛋白的表达情况。灰度分析光密度比值显示，ZD55－IL－24联合放疗、ZD55－IL－24组均可检测到E1A蛋白的表达，两组之间表达差异不明显，而放疗组、PBS对照组没有表达上的变化(图3)。灰度分析光密度比值显示，治疗组中Bax的表达显著增加，Bcl－2的表达量有所降低，而Bcl－2在ZD55－IL－24联合放疗组作用的黑素瘤细胞中的表达降低最为明显。实验中还发现ZD55－IL－24联合放疗组较其它治疗组能更显著发生Caspase－3剪切，生成有活性的Caspase－3(图3、4)。

图3 Western blot检测E1A、Bax、Bcl－2、Caspase－3凋亡相关蛋白的表达

图4 线粒体途径凋亡相关蛋白在不同处理组中的灰度分析比值

3 讨论

美国肿瘤放射治疗专家Weichselbaum提出将肿瘤的放射治疗和基因治疗两者结合应用，即肿瘤－基因放射治疗。6，7其含义是将同时具有肿瘤杀伤的基因转入体内，在对肿瘤实施局部放疗时诱导肿瘤杀伤基因表达，造成射线和基因对肿瘤的双重杀伤作用。这样一方面可以相对降低等效照射剂量，缓解正常组织的损伤；另一方面通过射线的局部照射来实现肿瘤杀伤基因的定位表达，为提高恶性肿瘤的治愈率及减少肿瘤复发带来了新希望。

本实验研究了ZD55－IL－24联合放疗模式对黑素瘤细胞的抑瘤效应及作用机制。Western blot证实ZD55－IL－24能在黑素瘤细胞内表达腺病毒复制早期蛋白E1A。诱导肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤生长的重要机制之一。为了阐明ZD55－IL－24联合放疗诱导黑素瘤细胞凋亡的机制，我们检测了ZD55－IL－24单独或联合放疗对黑素瘤细胞Bcl－2、Bax及Caspase－3蛋白的调节作用。ZD55－IL－24联合放疗作用的MV3细胞Bax的表达量增加，Bcl－2的表达量明显降低，Caspase－3发生了明显剪切。这些结果表明联合治疗可以通过改变促凋亡蛋白与抑制凋亡蛋白的平衡而诱导凋亡。

实验结果表明，介导IL－24基因的溶瘤腺病毒ZD55－IL－24能明显增强放疗对黑素瘤MV3细胞的杀伤效果，放疗同时不会干扰ZD55－IL－24在肿瘤细胞中的复制增殖。病毒－基因治疗和放疗依靠不同的机制发挥作用，对杀伤黑素瘤细胞有增强效应。

1 Viale DL，Cafferata EG，Gould D，et al.Therapeutic improvementof a stroma－targeted CRAd by incorporating motives responsive to themelanomamicroenvironment.J Invest Dermatol，2013，133(11):2576－2584.

2Ollila DW.Complete metastasectomy in patients with stage IV metastatic melanoma.Lancet Oncol，2006，7(11):919－924.

3杨春生，徐丹，蒋冠，等.Ki67启动子调控的肿瘤增殖腺病毒对黑素瘤细胞的杀伤作用.中国麻风皮肤病杂志，2012，28 (8):535－538.

4毛立军，郑骏年，李望，等.携带白细胞介素24基因溶瘤腺病毒对膀胱癌Biu87细胞的杀伤效应.中华实验外科杂志，2008，25(11):1479－1481.

5Seung LP，Mauceri HJ，BeckettMA，et al.Genetic radiotherapy overcomes tumor resistance to cytotoxic agents.Cancer Res，1995，55(23):5561－5565.

6Gupta VK，Park JO，Jaskowiak NT，et al.Combined gene therapy and ionizing radiation is a novel approach to treat human esophageal adenocarcinoma.Ann Surg Oncol，2002，9(5):500－504.

(收稿:2014－03－10 修回:2014－04－08)

Sensitivity to themelanoma cell line MV3 radiotherapy enhanced by oncolytic adenovirusmediated interleukin－24

SUN Chao，JIANGGuan，WEIZhi-ping，etal.DepartmentofDermatology，Affiliated Hospital ofXuzhou Medical College，Xuzhou，221002

Objective:To investigate the sensitivity to themelanoma cell line MV3 radiotherapy enhanced by oncolytic adenovirusmediated interleukin－24(ZD55－IL－24).Methods:The logarithm ic phase cells of melanoma cell line MV3 were divided into ZD55－IL－24＋radiotherapy group，ZD55－IL－24 group，radiotherapy group and PBS control group.Bax and Bcl－2 apoptosis related proteins of MV3 cells were measured by immunocytochemical staining.The expression of E1A proteins，Bax，Bcl－2 and Caspase－3 apoptosis related proteinswere detected byWestern blotting analysis.Results:The staining intensity of Bax was the strongest and the staining of Bcl－2 wasweakest in ZD55－IL－24 plus radiotherapy group，whenmeasured by immunocytochemical staining.Western blotting analysis showed that the expression of EIA was highest and the expression of Bax was also increased in ZD55－IL－24 plus radiotherapy group than other groups.The expression of Bcl－2 was decreased and the activation of Caspase－3 wasmore significant.Conclusion:ZD55－IL－24 conjugated with radiotherapy has a synergic effect in the killing ofmelanoma cells.

adenoviridae；melanoma；radiotherapy；apoptosis

国家自然科学基金资助项目(编号:81372916，81141102)

1徐州医学院附属医院皮肤科，江苏徐州，221002

2徐州医学院肿瘤生物治疗重点实验室，江苏徐州，221002

∗通信作者