异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠学习策略运动功能及生长发育的影响

徐莹，纪国余，王菲菲，杨雅婷，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉二科，沈阳110004）

异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠学习策略运动功能及生长发育的影响

徐莹，纪国余，王菲菲，杨雅婷，赵平

（中国医科大学附属盛京医院麻醉二科，沈阳110004）

目的探讨异氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤（HIBI）新生大鼠学习策略、运动功能及生长发育的影响。方法新生SD大鼠105只，体质量12～16 g，将大鼠随机分为7组（n=15）：假手术组、模型组、异氟醚组、苍术苷组、苍术苷+异氟醚组、环孢素组、环孢素+异氟醚组。各组均行左侧颈总动脉结扎术（假手术组不结扎），吸入8%O2+92%N2混合气体处理2 h，制备新生大鼠缺血缺氧性脑损伤（HIBI）模型。各组于建模（或假手术）后，侧脑室注射药物：苍术苷组及苍术苷+异氟醚组注射苍术苷；环孢素及环孢素+异氟醚组注射环孢素A；其余组注射生理盐水。在此基础上异氟醚组、苍术苷+异氟醚组及环孢素+异氟醚组予以1.5%异氟醚后处理30 min。于缺血缺氧后，21 d～28 d行悬吊实验，30 d～35 d行Morris水迷宫实验，水迷宫实验结束后测定大鼠体质量，评估各组大鼠的学习策略构成、运动功能及生长发育情况。结果与假手术组比较，其余组总学习型策略构成比小（P＜0.05）；与模型组比较，异氟醚组及两环孢素处理组总学习型策略构成比大（P＜0.05），而两苍术苷处理组总学习型策略无统计学差异（P＞0.05）；与异氟醚组比较，两苍术苷处理组非学习型游泳策略构成比大（P＜0.05），而两环孢素组总学习型策略无统计学差异（P＞0.05）。各组大鼠悬吊实验时间、游泳速度、游泳路程以及不同阶段体质量无统计学差异（P＞0.05）。结论异氟醚后处理对HIBI新生大鼠的运动功能及生长发育没有影响，但是可以改善HIBI新生大鼠的学习策略构成。

异氟醚；后处理；缺血缺氧性脑损伤；水迷宫；生长发育

围产期窒息导致的新生儿缺血缺氧性脑损伤（hypoxic-ischemia brain injury，HIBI）是对新生儿危害最大的常见疾病之一，常引起不可逆性的脑损害，最终导致严重的神经系统发育障碍，甚至新生儿死亡［1］，严重的损害了患儿的生活质量［2，3］，给患者家庭和社会带来巨大的精神和经济负担。本课题组前期的实验研究结果认为，异氟醚后处理通过抑制缺血缺氧性脑损伤所致的线粒体通道转换孔（mPTP）的开放对HIBI新生大鼠有长期的脑保护作用［4］，但是对于大鼠的学习策略、运动功能及生长发育的影响尚不清楚。我们应用HIBI模型，通过悬吊试验、Morris水迷宫实验及新生大鼠体质量变化，评估异氟醚后处理对HIBI新生大鼠的学习策略构成、运动功能及生长发育的影响，并通过加入苍术苷（mPTP特异性开放剂）和环孢素（mPTP特异性抑制剂）进一步探讨和证实异氟醚后处理对HIBI新生大鼠生长发育的远期预后及其影响机制。

1 材料与方法

1.1 模型制备及干预

新生SD大鼠105只，7 d龄，体质量（12～16）g，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。采用随机数字表法，将大鼠随机分为7组（n= 15）：假手术组（Ⅰ组）、缺血缺氧模型组（Ⅱ组）、异氟醚组（Ⅲ组）、苍术苷组（Ⅳ组）、苍术苷+异氟醚组（Ⅴ组）、环孢素组（Ⅵ组）、环孢素+异氟醚组（Ⅶ组）。参照Balduini等［5］方法并加以改良制备HIBI模型：面罩吸入4%异氟醚麻醉后，将大鼠固定在解剖实验台上，面罩吸入2%异氟醚维持麻醉，用0.2%典伏棉球消毒颈部皮肤，沿颈正中线行纵行切口，显微镜下分离左侧颈总动脉，用7-0丝线2次永久结扎左颈总动脉（Ⅰ组不结扎）；大鼠清醒后放回笼中继续喂哺（2～3）h，然后放入自制的半密闭箱（置于37℃的水浴箱中）内，箱底铺一层钠石灰吸收CO2和水蒸气，进气口连于装有异氟醚挥发罐的麻醉机，另一口连接于气体监护仪，监测半密闭箱内气体浓度。以2 L/min流量经进气孔向半密闭箱内持续输入含8%氧气、92%氮气的湿化混合气体2 h（Ⅰ组不吸入）。模型制备后参照Satoh等［6］的方法，于复氧前行侧脑室注射药物：Ⅳ组及Ⅴ组注射2 mmol/L的苍术苷（mPTP特异性开放剂）5 μL，Ⅵ组及Ⅶ组注射2 μmol/L的环孢素A（mPTP特异性抑制剂）5 μL，其他各组注射等量生理盐水（2～3 μL/min），注射完毕后留针3～5 s，缓慢退针。室温下各组均放入半密封箱内，Ⅲ组、Ⅴ组及Ⅶ组吸入含1.5%异氟醚的湿化混合气体（30%氧气、70%氮气以2 L/min的流量输入）30 min，其余组吸入不含异氟醚的湿化混合气体30 min，各组均于自然环境中恢复30 min，完全清醒后放回母鼠身边继续喂哺。

1.2 实验方法

1.2.1 悬吊试验：参照Bona等［7］的方法。制模后第21～28天行悬吊试验：让大鼠前肢抓住一根直径为0.6 cm的水平塑料绳，绳距地高度大于45 cm。大鼠从绳上掉下或悬吊时间超过60 s时，或其后肢抓到绳子时的时间为悬吊时间。每日下午3：00进行1次。

1.2.2 Morris水迷宫实验：制模后第（30～35）天行水迷宫实验：水迷宫为直径160 cm、高60 cm的圆水池，池壁为均匀黑色，等分为4个象限，每个象限设置一入水点，第四象限内距池壁30 cm处隐藏1个直径12 cm的圆柱形平台（位于水面下约1.5 cm处），水温控制在（20±1）℃，水槽上方安装有自动监视系统，能够同步记录大鼠在水池里的运动情况。

1.2.2.1 定位航行实验实验前1 d分别将各组大鼠放入水池（不含平台）内自由游泳90 s，让其熟悉水池环境。实验第1～5天每日9：00行定位航行实验：大鼠面向池壁，按照随机顺序分别从四个象限的入水点放入水中，强迫其寻找水下平台。实验过程中，水迷宫图像监视系统自动记录大鼠的运动轨迹，应用相应软件系统分析判断运动策略。运动策略分为4种：边缘式策略以大鼠的运动区域中心为圆心，取半径的75%作一个圆，大鼠70%以上的时间均在该圆外活动；直线式策略以大鼠入水后找到的第一个点与站台之间的连线为中轴，大鼠的所有运动轨迹点与中轴的距离均不超过半径的15%，并且在设定区域中运动的时间至少占运动总时间的70%，表明动物根据迷宫外线索逐渐形成参考认知；趋向式策略与直线式的策略相似，但运动轨迹范围在半径的50%内；若大鼠的运动策略与以上3种均不同，则判定为随机式策略。其中直线式和趋向式策略为学习型策略，随机式和边缘式策略为非学习型策略。

1.2.2.2 空间探索实验实验第6天，移走平台，从第二象限的入水点将大鼠面向池壁放入水中，图像监视系统自动追踪，记录其90 s内游泳路程、游泳速度（游泳路程/90 s）。实验测试过程中保持室内安静，迷宫外物体和灯光的摆放位置不变，灯光强度保持恒定，每次实验结束后将大鼠擦干后放回笼中，注意保暖，让其自由饮食水；每个训练日结束后清理水迷宫更换新水以消除嗅觉和环境因素的干扰。

1.2.3 大鼠生存情况及其体质量变化：水迷宫实验结束后，记录各组生存情况及其体质量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件分析采集的数据。计量资料以表示，组间比较用单因素方差分析，样本均数两两比较用LSD检验；学习策略组间差异比较用非参数检验中的Mann-Whitney U秩和检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 悬吊时间及体质量变化

水迷宫实验结束时共6只大鼠死亡；各组大鼠悬吊实验结果、缺血缺氧前及缺血缺氧后35 d体质量无统计学差异（P＞0.05），见表1、2。

表1 各组大鼠每天悬吊实验结果比较Tab.1 Suspension test results of each group

表1 各组大鼠每天悬吊实验结果比较Tab.1 Suspension test results of each group

表2 各组大鼠缺血缺氧前及缺血缺氧后35 d体质量比较Tab.2 Body weights of each group before and 35 d after HIBI

表2 各组大鼠缺血缺氧前及缺血缺氧后35 d体质量比较Tab.2 Body weights of each group before and 35 d after HIBI

2.2 水迷宫实验结果

2.2.1 定位航行试验学习策略：与Ⅰ组比较，其余组总学习型策略构成比小（P均＜0.05）；与Ⅱ组比较，Ⅲ组及Ⅵ、Ⅶ处理组总学习型策略构成比大（P均＜0.05），而Ⅳ、Ⅴ处理组总学习型策略无统计学差异（P均＞0.05）；与Ⅲ组比较，Ⅳ、Ⅴ处理组非学习型策略构成比大（P均＜0.05），而Ⅵ、Ⅶ处理组总学习型策略无统计学差异（P均＞0.05），见表3。

2.2.2 定位航行试验：各组大鼠游泳速度及游泳总路程组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

3 讨论

新生大鼠的HIBI模型是模拟新生儿缺血缺氧性脑病最常用的模型，7 d龄的大鼠脑处在突触形成期［8，9］。研究认为，出生5～7 d大鼠的脑发育程度与足月新生儿的脑发育程度相当，15 d大鼠的脑发育程度与1岁儿童相当，28～30 d大鼠的脑发育程度与2岁儿童相当［10］，出生1～2 d到出生2周是大鼠脑发育的关键阶段［11］，而哺乳动物幼儿期是认知学习能力形成的关键时期，也是海马神经元发育的重要时期。因此，本实验利用7 d龄新生大鼠的HIBI模型模拟新生儿HIBI。

表3 各组大鼠定位航行试验学习策略（学习型/非学习型）构成比的比较Tab.3 Proportion of learning strategies of each group

表4 各组大鼠空间游泳实验游泳速度及游泳总路程比较Tab.4 Swimming speeds and swimming routes of each group

表4 各组大鼠空间游泳实验游泳速度及游泳总路程比较Tab.4 Swimming speeds and swimming routes of each group

学习记忆功能障碍是缺血缺氧性脑损伤后常见的神经后遗症之一，而学习功能是人类认知功能中最核心、最重要的部分。Morris水迷宫是用于研究动物学习记忆功能的重要评估工具，对大鼠海马损伤后的学习记忆功能的检测特别敏感，是目前最为常用的一种评估与海马相关的空间学习记忆功能的方法［12］。本课题组研究已证实吸入1.5%的异氟醚30 min，可通过抑制脑部缺血缺氧导致的mPTP的开放而减轻新生儿HIBI［13～15］，并且可以改善HIBI新生大鼠的学习记忆功能［4］，但对于其学习策略、运动功能及体质量变化的影响尚不清楚。本实验结果显示，与假手术组比较，学习型策略构成比减小，表明HIBI后大鼠的学习记忆能力降低；与模型组比较，异氟醚组及两环孢素处理组学习型策略构成比增大，表明异氟醚后处理及环孢素可以改善HIBI大鼠的学习策略的构成；而加入了mPTP的特异性开放剂的苍术苷+异氟醚组，由于逆转了异氟醚后处理脑保护作用中的mPTP的开放抑制，进而抑制了异氟醚对HIBI大鼠的学习策略的改善作用；而苍术苷组与模型组比较组间差异无统计学意义，说明苍术苷本身不会进一步加重缺血缺氧所致的mPTP的开放。悬吊实验能够评价大鼠的四肢肌力，客观反映大鼠的感觉运动功能［7，16］，本研究中，各组大鼠的悬吊时间、游泳速度（空间探索实验）及游泳路程（空间探索实验）各组间无显著差异，表明各组大鼠运动功能未受缺血缺氧及异氟醚的影响。然而，也有研究表明将HIBI的小鼠放于Rotarod仪上，小鼠的运动功能低于假手术组［17］，这一结果与我们的实验结果不一致。因此本研究仅通过悬吊实验、游泳速度及游泳路程来评估大鼠运动功能可能尚有不妥之处，所以在后续研究中，我们将选择其他方法进一步评估异氟醚后处理对HIBI大鼠运动功能是否具有影响。Morris水迷宫实验后，各组大鼠生存情况及体质量的变化无差别，表明实验所有操作并不影响大鼠长期的存活和体质量的增长。

综上所述，根据本实验结果我们认为异氟醚后处理对HIBI新生大鼠的运动功能及体质量没有影响，但是可以改善HIBI新生大鼠的学习策略的构成，其机制是通过抑制缺血缺氧所致的脑组织mPTP的开放实现的。目前研究表明异氟醚后处理的相关脑保护作用是多种机制的综合作用结果，对学习策略构成的改善是否有其他机制的参与，还需要进一步研究。

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（编辑 裘孝琦）

EffectsofIsoflurane Postconditioning on Learning Strategies，Motor Function and Growing Developmentof Hypoxic-ischemia Brain Injury in NeonatalRats

XUYing，JIGuo-yu，WANGFei-fei，YANGYa-ting，ZHAO Ping
（DepartmentofAnesthesiology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effectsofisoflurane postconditioning on learning strategies，motorfunction and growing developmentofhypoxic-ischemia brain injury（HIBI）in neonatal rats.MethodsA total of 105 Sprague-Dawley（SD）neonatal rats were randomly divided into 7 groups using the random number table method：sham surgery group，model group，isoflurane group，atractyloside group，atractyloside with isoflurane group，cyclosporine group and cyclosporine with isoflurane group.To establish HIBI models，each group underwent the left common carotid artery ligation（sham group threading without ligation），and inhaled 8%oxygen，92%nitrogen mixed gas.After model was established（or sham surgery），drug administration was performed through lateral ventricle：atractyloside group and atractyloside with isoflurane postconditioning group were injected atractyloside，cyclosporine group and cyclosporine with isoflurane postconditioning group were injected cyclosporine A，othergroups were injected saline.On this basis，in soflurane postconditioning group，atractyloside with isoflurane postconditioning group and cyclosporine with isoflurane postconditioning group，1.5%isoflurane were inhaled continuously for 30 min.After brain hypoxia-ischemic brain injury，conducting tail suspension test on the 21st to 28th days，and Morris water maze test on the 30th to 35th days，and body weight of rats in each group was measured after water Morris maze test，learning strategies，motor function and growing development of each group rats were evaluated.ResultsCompared with the sham surgery group，the proportion of learning strategies was decreased in other groups（P＜0.05）.Compared with model group，the proportion of learning strategies were increased in isoflurane group，cyclosporine group and cyclosporine with isoflurane group（P＜0.05）.There were no significantly difference between atractyloside group and atractyloside with isoflurane group（P＞0.05）.Compared with isoflurane group，the propotion of learning strategies were decreased in atractyloside group and atractyloside with isoflurane group（P＜0.05）.There were no significantly difference between cyclosporine-group and cyclosporine with isoflurane group（P＞0.05）.There was no significantly difference among each group in suspension time，swimming speed，swimming routes and body weight of each stage（P＞0.05）.ConclusionIsoflurane postprocessing have no effect on motor function or growing development，butitcan improve learning strategiesofHIBIin neonatalrats.

isoflurane；postconditioning；hypoxic-ischemia brain injury；orris water maze；growing development

R614.2

A

0258-4646（2014）12-1066-05

国家自然科学基金（81171782）

徐莹（1977-），女，讲师，博士.

赵平，E-mail：zhaop@sj-hospital.org

2014-08-29

网络出版时间：