固有免疫系统Toll⁃Like受体和炎性小体在炎症及衰老中的作用

白雪源 邵枫 刘永泉

固有免疫系统Toll⁃Like受体和炎性小体在炎症及衰老中的作用

白雪源 邵枫 刘永泉

白雪源 教授

Toll样受体（Toll⁃like receptors，TLRs）作为固有免疫系统受体之一，在启动和调节天然免疫及诱导获得性免疫中发挥重要作用。炎性小体也是固有免疫的重要组分，能被多种类型的病原体或危险信号所激活，在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用。虽然已经提出多种衰老学说如氧化应激（oxidative stress）等，但是目前衰老的机制还不是很清楚［1］。近年研究发现免疫炎症与衰老的发生有关，但是固有免疫TLRs系统与炎性小体与衰老及其相关疾病的关系目前尚不清楚。

1 TLRs的结构、配体与信号转导通路

TLRs是人们在研究果蝇胚胎发育过程中发现的dToll基因（dToll）所编码的一种跨膜受体蛋白，随后在人类细胞表面鉴定出与其同源的Toll样蛋白，并命名为TLRs。TLRs不仅在天然免疫中发挥重要的作用，而且还可以调控获得性免疫反应（adaptive immunity）。

1.1 TLRs的结构 TLRs分子均由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成，属Ⅱ型跨膜受体。其胞外区均有18～31个富含亮氨酸的串联重复序列（leucine⁃rich repeat，LRR），该区为序列多变的Ig样结构域，与宿主对感染反应的特异性有关，其空间结构的细微变化就会影响TLRs对病原相关分子模式（pathogen associated molecular pat⁃tern，PAMP）的识别。TLRs的胞内区含有Toll／IL⁃1受体同源区（Toll／IL⁃1 receptor homologous region，TIR），其中包括3个保守盒（con⁃served boxes），参与信号转导［18］。TIR是一保守结构，TLRs信号转导通路上的许多蛋白质，如髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、白介素⁃1（IL⁃1）受体相关蛋白激酶（IL⁃1 receptor⁃associated kinase，IRAK）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6，TRAF6）等都具有TIR。

1.2 TLRs的分布、配体 TLRs在生物界高度保守、分布广泛，但不同生物TLRs的种类和数量不尽相同。已经发现哺乳动物TLRs有13个成员，其家族成员主要表达于各种免疫相关的细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。

TLRs属于模式识别受体（pattern cognition receptors，PRRs），能识别结合PAMPs。PAMPs包括革兰阴性菌的脂多糖（lipopolysac⁃charide，LPS），革兰阳性菌的肽聚糖、脂磷壁酸、磷壁酸，分枝杆菌的脂糖，真菌的甘露聚糖，病毒的RNA、表面蛋白，革兰阳性菌、分枝杆菌、螺旋体中的脂蛋白，细菌鞭毛蛋白，以及一些微生物的CpG DNA、dsRNA、ssRNA。近年的研究发现，TLRs还可识别一些内源性配体，这些配体也称为损伤相关分子模式（damage⁃associated molecular patterns，DAMPs），比如热休克蛋白（HSPs）、细胞外基质的降解产物、自身的核酸成分等。自由脂肪酸和高糖作为TLR2和TLR4的内源性配体可以诱导产生促炎因子（proinflammatory factors）。

1.3 TLRs的信号转导通路 TLRs信号转导通路包括MyD88依赖性通路和MyD88非依赖性通路。MyD88依赖性通路是指当TLRs胞外段与相应配体结合后，TIR即发生二聚化并与MyD88的Toll结构域结合，同时诱导MyD88的死亡结构域活化而形成TIR⁃MyD88活性复合体；MyD88用它的死亡结构域募集下游同样含死亡结构域的I⁃RAK1和IRAK2，导致IRAK自身磷酸化；磷酸化的IRAK脱离MyD88，与TRAF6结合，导致TRAF6活化，并引起丝裂原激活蛋白激酶（mito⁃gen⁃activated protein kinase，MAPK）家族成员NK（NF⁃κB⁃inducing ki⁃nase）磷酸化，NK活化后激活κB抑制剂激酶（inhibitior of kappa B kinase，IKK），导致κB抑制剂（in⁃hibitior of kappa B，IκB）泛素化而从IκB／核因子κB（nuclear factor kappa B，NF⁃κB）复合物中释放出来，NF⁃κB由此活化并转位入核，从而激活一系列促炎因子基因的表达。MyD88非依赖性通路，包括TLR3和TLR4。TLR3的MyD88非依赖信号通路是通过诱导TRIF（Toll／IL⁃1 domain containing adaptor protein inducing IFN⁃β）激活TANK（TRAF joint NF⁃κB kinase）结合激酶1（TANK⁃binding kinase 1，TBK1），进而促进干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）的激活，诱导干扰素β等基因的表达。TLR4除了参与MyD88依赖性通路之外，还参与MyD88非依赖性通路，它可能主要调控TLR4介导的树突状细胞的成熟和获得性免疫正向调节分子，如主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）、共刺激分子CD80。

1.4 炎性小体的结构与功能 炎性小体（inflammasome）也称炎症小体，分子量约700 kD，由Tschopp研究小组于2002年首次提出［2］。它是由胞浆内PRRs参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。它能够识别PAMPs或者宿主细胞自身的DAMPs，招募和激活促炎症蛋白酶caspase⁃1。活化的caspase⁃1切割IL⁃1β和IL⁃18前体，产生相应的成熟炎症因子。其还能调节caspase⁃1依赖的炎症坏死，诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡。目前已经确定多种炎性小体参与了针对多种病原体的宿主防御反应，病原体也已经进化出多种相应的机制来抑制炎性小体的活化。

目前已发现的炎性小体主要有4种，即NLRP1炎性小体、NLRP3炎性小体、IPAF炎性小体和AIM2炎性小体。已知发现的炎性小体一般均含有凋亡相关微粒蛋白（apop⁃tosis⁃associated speck⁃like protein containing CARD，ASC）、caspase蛋白酶以及一种NOD样受体（NOD⁃like receptor，NLR）家族蛋白（如NLRP1）或HIN200家族蛋白（如AIM2）。

其中NLRP3炎性小体作为固有免疫的重要组分，能被多种类型的病原体或内源性损伤分子所激活，在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用，包括最初被确认的家族性周期性自身炎症反应、2型糖尿病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化症等。NLRP3炎性小体在抵抗流感病毒感染中也起重要作用。NLRP3、ASC和caspase⁃1缺陷的小鼠在流感病毒感染时呼吸道炎症明显削弱且死亡率显著提高。流感病毒感染的NLRP3和caspase⁃1缺陷型小鼠IL⁃1β和IL⁃18的分泌也显著降低。与野生型小鼠相比，NLRP3缺陷小鼠肺泡内有大量的胶原沉淀物，并表现出严重的上皮细胞坏死和呼吸衰竭，提示NLRP3炎性小体在感染后的组织修复中发挥作用。此外，NLRP3炎性小体的活化在诱导适应性抗病毒免疫中也发挥重要作用［19］。

2 TLRs信号通路与衰老的关系

衰老可以导致慢性炎症的发生［3］。TLRs作为天然免疫系统受体之一，在诱导天然免疫及获得性免疫应答中发挥重要作用。但是目前对TLRs系统在肾脏器官衰老中的作用尚不清楚。我们应用免疫印迹（western blot）和实时定量PCR（qRT⁃PCR）技术首次系统性地分析了3月龄组（青年组）、12月龄组（中年组）和24月龄组（老年组）大鼠肾脏中TLRs系统分子、NF⁃κB信号通路分子IκBα，NF⁃κB与Phospho⁃NF⁃κB（活化的磷酸化NF⁃κB）以及炎症因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF⁃α和IL⁃12b的表达变化情况。结果发现在肾脏衰老过程中TLR1、2、3、4、5、11及TLRs信号通路下游分子MyD88的表达水平显著升高。进一步研究显示在衰老肾脏中NF⁃κB信号通路分子IκBα、NF⁃κB与Phospho⁃NF⁃κB表达明显升高，炎症因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF⁃α和IL⁃12b的表达明显上调。表明TLRs系统可能通过激活NF⁃κB信号通路、促进炎症因子的表达而在肾脏衰老过程中发挥重要作用［20］。

循环炎症细胞因子水平的增加是衰老的重要因素，导致动脉粥样硬化。但是，血管细胞在衰老诱导的慢性炎症中的作用目前尚不明确。Song等［3］采用western blot、qRT⁃PCR和ELISA（酶联免疫吸附测定）分析了青年组（2～4月）和老年组（16～18月）小鼠主动脉在非刺激状态下的炎症反应。发现衰老主动脉中IL⁃6基础水平升高，衰老的大动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）分泌更多的基础IL⁃6。已发现在衰老的VSMC中趋化因子（如CCL2）、黏附分子（如intracellular adhesion molecule 1，ICAM⁃1）、固有免疫受体（如TLR4）表达上调。他们还分析了衰老TL4⁃／⁃和Myd88⁃／⁃小鼠的VSMC，发现TLR4及其信号分子MyD88与衰老时IL⁃6表达增加密切相关。TLRs不仅由微生物所激活，也可被内源性配体如透明质酸或被氧化的LDL等所激活［4］。

与衰老组织器官中TLRs表达情况不同的是，在老年人血液细胞中TLRs的表达基本呈下降趋势，而在衰老猴血液中TLR的表达却是多种多样的。Van Duin等［5⁃6］发现，在人的外周血单核细胞中，TLR1的表达在老年人中下降了36%，而TLR2不受影响，同时老年人中通过TLR1／2复合物所产生的细胞因子减少。有研究认为，老年人的TLR功能是受损伤的，或者在特定状态下有非正常的持续激活的TLR［7］。Panda等［8］发现，pDCs中的TLR1／2，TLR2／6，TLR3，TLR5和TLR8复合物及pDCs中的TLR7和TLR9在衰老人群中均显著下降。有人研究恒河猴后发现，一方面，TLR4、TLR2／6和TLR7／9在衰老mDCs中下降，另一方面，TLR4和TLR5在外周单核细胞中年轻者却较衰老者有显著下降［9］。

3 炎症系统（IKK⁃NF⁃κB与炎症因子、炎性小体）与衰老的关系

近年研究发现随着年龄的增长，机体出现一种全身性、慢性、低水平炎症反应状态。炎性衰老是机体衰老速率和寿命的一个决定因素，也是多种慢性疾病发生的一个主要危险因素。老年个体出现持续低度的炎性衰老现象，与机体物理因素及生理因素变化有关［10］。比如衰老过程中，自身抗原清除不够或延迟、解剖屏障的改变、氧化压力增加以及蛋白翻译后修饰的改变等［11］。

炎症作为细胞衰老及机体老化的伴随反应，在维持和促进衰老过程中发挥重要的作用。目前，炎性衰老的机制主要有应激学说和细胞因子学说。应激学说认为，衰老过程中机体长期处于应激原微环境中，持续过度的应激反应引起的促炎症反应状态可导致炎性衰老［12］。细胞因子学说认为促炎细胞因子（如IL⁃15等）在炎性衰老发生发展过程中起着核心作用［10］。有研究认为，衰老过程中，机体内促炎性细胞因子如TNF⁃α、IL⁃β以及IL⁃6等的长期刺激可导致慢性、低度、微炎性的炎性衰老状态，从而引起或增加衰老相关的退行性疾病的发生［13］。

炎症与许多衰老相关性疾病发生发展相关，如动脉粥样硬化、关节炎、肿瘤、糖尿病、骨质疏松症、痴呆、血管病变、肥胖和代谢综合征等［11］。目前广泛认为长期慢性低水平炎症在代谢性疾病的启动及进展中均发挥重要作用。最近的研究发现，NF⁃κB信号通路在代谢性疾病的发病机制中发挥重要作用［14］。炎症与老年人肿瘤的发生涉及内源性和外源性通路，内源性通路中，TNF⁃α可以激活NF⁃κB，而NF⁃κB在肿瘤的发生及转移方面有极其重要的作用；外源性通路中，如CD4＋T细胞通过上调基质金属蛋白酶⁃9（MMP⁃9）在癌前病变期加速了新生血管的形成及细胞不典型增生，从而促进肿瘤的发生［15］。恶性肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞可通过促进肿瘤细胞生存、增殖和侵袭来促进肿瘤发展。

IKK通路是介导炎症反应的一条非常重要的信号通路。IKK由 IKKα和IKKβ两个催化亚基，及IKKγ一个调节亚基组成。细胞表面的各种受体如TLR⁃4、TNF⁃γ及IL⁃1R等均可与相应的配体结合，激活该信号通路，活化后的IKK通过激活NF⁃κB介导炎症反应的发生。有关IKK信号通路在炎性衰老过程中的作用正越来越受到重视。Deng等［16］发现，老龄小鼠CD4＋T细胞中IKKβ的表达及活性均比青年组高，衰老CD4＋T细胞分泌促炎性细胞因子增多。

最近有关炎性小体的研究证实，炎症与衰老过程中的功能衰退呈因果关系。NLRP3炎性小体作为一种特异的传感器，是衰老过程中炎症驱动的功能丧失（如胰岛素抵抗、骨质流失和认知能力下降）的一个共同触发因子。炎性小体随年龄增长激活了炎症反应。喂给正常饮食的无病小鼠形成小鼠的正常衰老过程，结果发现，免疫传感器NlRP3炎性小体响应衰老而激活。随后又对小鼠进行了测试，以确定NLRP3炎性小体活性下降是否减少了炎症反应以及衰老相关的功能衰退。结果表明，NLRP3炎性小体较低水平激活的小鼠可以免于老年痴呆、骨质流失、葡萄糖耐受不良、白内障和胸腺退化等许多衰老相关疾病。在功能上这些小鼠也表现得更好，不那么虚弱，能够跑更长的时间［17］。现在关于固有免疫TLRs的研究越来越多，而炎性小体作为固有免疫的重要组分，它们参与了许多疾病的发病过程［18⁃20］。目前已经公认衰老与炎症相关，但TLRs及炎性小体在衰老及衰老相关疾病中的作用有待进一步的深入研究。

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R 339.38

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.02.005

2013⁃12⁃10）

国家973计划项目（2011CBA01003，2011CB964904）

100853北京市，中国人民解放军总医院肾病科，肾脏疾病国家重点实验室（白雪源，邵枫）；101100北京市，北京市通州区潞河医院肾内科（刘永泉）