微小RNA⁃21在顺铂联合5⁃氟尿嘧啶抑制肺癌细胞株作用中的表达变化

肖霞 李树春 吴建中 马蓉 曹海霞 冯继锋

微小RNA⁃21在顺铂联合5⁃氟尿嘧啶抑制肺癌细胞株作用中的表达变化

肖霞 李树春 吴建中 马蓉 曹海霞 冯继锋

目的探讨顺铂和5⁃氟尿嘧啶在体外联合用药对肺癌细胞株A549细胞存活率、细胞周期的影响以及在这过程中微小RNA⁃21（microRNA⁃21，miR⁃21）表达水平的变化。方法顺铂和5⁃氟尿嘧啶单药或联合用药处理肺癌A549细胞后，采用CCK⁃8法检测细胞存活率；倒置显微镜观察细胞形态变化；流式细胞仪技术检测细胞周期；实时荧光定量PCR检测miR⁃21的表达变化。结果顺铂和5⁃氟尿嘧啶单药对A549细胞的抑制作用都具有浓度依赖性，两者联合用药48 h后细胞的存活率明显低于单药组（P＜0.05），并且细胞形态改变更加明显，悬浮、变圆的细胞也更多；顺铂处理A549细胞后，将细胞阻滞于S期和G2期，5⁃氟尿嘧啶阻滞A549细胞于S期，联合用药后细胞阻滞于S期和G2期；随着顺铂和5⁃氟尿嘧啶作用浓度的增加，miR⁃21的表达水平上调，联合用药后miR⁃21的表达亦上调，但趋势没有顺铂组明显（P＜0.05）。结论顺铂在体外联合5⁃氟尿嘧啶对A549细胞存活率的抑制有协同作用，同时可以上调细胞内miR⁃21表达水平。

顺铂；5⁃氟尿嘧啶；微小RNA⁃21；非小细胞肺癌；A549细胞

全球范围内，肺癌是致死率最高的肿瘤之一，在所有男性因癌症死亡病例者中肺癌占29%，在女性癌症死亡病例者中肺癌占26%［1］，肺癌已成为肿瘤领域中研究最多的肿瘤之一。顺铂作为非小细胞肺癌化疗方案中的一线药物，其对肿瘤的细胞毒作用主要是通过形成铂⁃DNA复合物，但其耐药性制约了其疗效［2⁃3］。5⁃氟尿嘧啶主要通过阻断脱氧嘧啶核苷酸转化为胸腺嘧啶核苷酸而干扰DNA的合成。然而顺铂联合5⁃氟尿嘧啶处理人肺腺癌细胞株A549细胞的研究报道还不是很多，尤其是机制研究更是很少。最近有文献报道微小RNA⁃21（microRNA⁃21，miR⁃21）介导参与了非小细胞肺癌顺铂耐药过程［4］。至于miR⁃21在顺铂联合5⁃氟尿嘧啶对A549细胞处理过程中的表达水平尚不清楚。本研究主要探讨顺铂在体外联合5⁃氟尿嘧啶对A549细胞的存活率、细胞周期分布及miR⁃21表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 CO2培养箱（Thermo，US），RPMI⁃1640不完全培养基（凯基生物），胎牛血清（Hy⁃clone），0.25%胰蛋白酶（GIBCO，USA），DMSO（Bio⁃sharp，USA），生物安全柜（BIOBASE），生理盐水（南京小营药业集团有限公司），顺铂（Sigma，USA），5⁃氟尿嘧啶（Sigma，USA），CCK⁃8（日本Dojindo Laboratorise），酶标自动分析仪（Bio⁃Tech，US），试剂盒miRACLE isolation kit for cells／tissues（Jinfiniti Biosci⁃ences，US），OD⁃1000＋Spectrophotometer（One Drop），TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（ABI，US），TaqMan MicroRNA Assays（ABI，US），Thermocycler（Biometra，Germany），ABI PRISM 7900 systerm（Applied Biosystems），流式细胞仪（Becton⁃Dickinson，San Jose，CA，USA）。

1.2 细胞系及细胞培养 人肺腺癌细胞株A549订购于中国科学院上海细胞生物学研究所。细胞接种在含10%胎牛血清、80 U／ml青霉素和0.08mg／ml链霉素的RPMI⁃1640培养基中，置于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养。细胞呈贴壁生长，3 d后按1∶4传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 CCK⁃8细胞活力检测 取对数生长期的A549细胞消化，制备单细胞悬液，以浓度为6×103个／孔接种于96孔板中（100μl／孔），置于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养24 h。贴壁后经不同浓度顺铂及5⁃氟尿嘧啶处理（每个药物浓度设3个复孔，终体积为200μl／孔）并分别培养24、48 h后，去除培养液，每孔加入10μl CCK⁃8试剂和90μl RPMI⁃1640不完全培养基（终体积为100μl／孔），孵育50 min后用酶标仪（波长为450 nm）测定每孔A值，按下列公式计算细胞存活率：存活率＝［（实验组平均A值⁃空白对照组A值）／（实验对照组平均A值⁃空白对照组A值）］×100%。实验重复3次。

1.4 细胞形态观察 对数生长期的A549细胞消化，制备单细胞悬液，接种于6孔板中（2 ml／孔），置于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养24 h。贴壁后经不同浓度顺铂及5⁃氟尿嘧啶处理（终体积为3 m l／孔）并培养48 h后用倒置显微镜观察细胞形态变化。

1.5 细胞周期检测 取对数生长期A549细胞消化，制备单细胞悬液，接种于6孔板（2ml／孔），置于37℃、5% CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养24 h。贴壁后经不同浓度顺铂及5⁃氟尿嘧啶处理（终体积为3ml／孔）并培养48 h后收集贴壁细胞和上清液中的死细胞，用PBS洗涤2次后用250μl RPMI⁃1640不完全培养基重悬，并加入750μl 75%酒精固定，于－20℃冰箱保存过夜后用PBS洗涤离心并重悬，加入50μg／μl PI染色并于室温避光孵育30min后过300目筛网，置流式管中用流式细胞仪检测细胞周期，实验重复3次。

1.6 miR⁃21的表达检测 取对数生长期的A549细胞消化，制备单细胞悬液，接种于6孔板中（2 ml／孔），置于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养24 h。贴壁后经不同浓度顺铂及5⁃氟尿嘧啶处理（终体积为3 ml／孔），培养48 h后收集贴壁细胞。以试剂盒miRACLE isolation kit for cells／tissues提取细胞中的RNA，OD⁃1000＋Spectrophotometer测定RNA浓度并通过A260／280及A260／230的吸收比值判断RNA的纯度。将RNA逆转录合成cDNA，然后以cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增（U6 snRNA为内参）。数据采用2⁃ΔΔCt法进行分析，重复实验3次。

1.7 统计学方法 所有数据均使用SPSS 12.0进行分析。实验结果均用±s表示，均数比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 顺铂和5⁃氟尿嘧啶单药及联合用药对A549细胞的抑制作用 CCK⁃8结果显示，以不同浓度的顺铂、5⁃氟尿嘧啶分别处理A549细胞24、48 h后，两单药皆可诱导抑制A549细胞活力，进而降低细胞存活率，证明顺铂和5⁃氟尿嘧啶都对A549细胞存在抑制作用，且对A549细胞的抑制作用具有时间、浓度依赖性（图1A、B）。以4、6μg／ml的顺铂处理A549细胞48 h后，细胞存活率分别为（55.06±6.06）%和（15.10± 4.10）%；以4μg／ml的5⁃氟尿嘧啶处理A549细胞48 h后，细胞存活率为（57.17±2.17）%；以4、6μg／ml的顺铂和4μg／ml的5⁃氟尿嘧啶联合处理A549细胞48 h后，细胞存活率分别为（15.53±3.53）%和（4.15± 3.15）%。联合用药组与单药组相比，组间差异有统计学意义（P＜0.05），见图1C。

图1 不同浓度的顺铂、5⁃氟尿嘧啶单药24 h或48 h及联合用药处理A549细胞48 h后的细胞存活率

2.2 联合用药对A549细胞形态改变的影响 以4 μg／ml的顺铂处理A549细胞48 h后，倒置显微镜观察到细胞形态发生明显变化，4μg／ml的5⁃氟尿嘧啶处理A549细胞48 h后，倒置显微镜亦观察到细胞形态发生明显变化，联合用药后细胞形态比单药变化更明显，且贴壁细胞数与CCK⁃8所得存活率结果相似。见图2（封二）。

2.3 联合用药对A549细胞周期的影响 以4μg／ml的顺铂处理A549细胞48 h后，G1期细胞减少，S期和G2期细胞增加；4μg／ml的5⁃氟尿嘧啶处理A549细胞48 h后，G1期和G2期细胞减少，S期细胞增加；两药联合处理细胞48 h后G1期细胞减少，S期和G2期细胞增加（表1）。各实验组间细胞周期分布的比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同实验组处理48 h后A549细胞周期的改变（±s）

表1 不同实验组处理48 h后A549细胞周期的改变（±s）

注：与对照组比较，∗P＜0.05；与顺铂组比较，△P＜0.05

组别细胞周期（%）G0／G1 S G2／M对照组71.04±0.90 21.39±0.98 7.57±0.20顺铂组15.42±4.68∗27.53±2.43∗57.05±0.61∗5⁃氟尿嘧啶组54.35±2.85∗40.36±3.24∗5.29±0.29∗联合组50.82±3.38△39.91±2.09△9.27±0.63△

2.4 顺铂和5⁃氟尿嘧啶单药及联合用药后A549细胞中miR⁃21的表达变化 qRT⁃PCR检测结果发现在以终浓度为1、2、4、6μg／ml的顺铂诱导的A549细胞活力降低过程中，miR⁃21的表达有差异（图3）。在顺铂诱发的A549凋亡（或死亡）中，miR⁃21的表达增加，而且在相同暴露时间内，随着顺铂作用浓度的增加，miR⁃21的表达逐渐增加（图3A）。在5⁃氟尿嘧啶诱发的A549凋亡（或死亡）过程中，miR⁃21的表达增加，且在5⁃氟尿嘧啶暴露48 h后，随着5⁃氟尿嘧啶作用浓度的增加，miR⁃21的表达增加趋势更加明显（图3B）。

以终浓度为4、6μg／ml的顺铂处理A549细胞48 h后，miR⁃21的表达分别上调（4.29±0.2）倍、（5.36± 0.12）倍；以4μg／ml的5⁃氟尿嘧啶处理A549细胞48 h后，miR⁃21的表达上调（4.37±0.2）倍；联合用药48 h后miR⁃21的表达分别上调（3.72±0.18）倍、（4.75± 0.2）倍，上调倍数低于顺铂组。联合用药组与顺铂组相比，差异有统计学意义（图3C）。

3 讨论

2012年的癌症数据表明自1999年起癌症死亡率逐年下降超过1%，其中肺癌占据男性总下调比的40%左右［1］，肺癌的治疗效果对整个癌症领域病死率的降低都有很大的影响。顺铂作为NCCN指南中非小细胞肺癌的一线治疗药物之一，其效果有目共睹，但是随着晚期癌症治疗的开展，其获得性耐药的问题日益显著，以致于其治疗效果受到限制，成为临床治疗中的瓶颈［2］。顺铂属于细胞周期非特异性药物，主要通过与DNA单链内两点或双链发生交叉联结，从而抑制细胞的DNA复制过程，使之发生细胞凋亡［5］。5⁃氟尿嘧啶属于不典型的细胞周期特异性药物，其主要是在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶来阻断脱氧嘧啶核苷酸转换成胸腺嘧啶核苷酸，从而干扰DNA的合成。已有文献报道顺铂联合5⁃氟尿嘧啶对肿瘤细胞的抑制具有协同作用，本研究以肺癌细胞株A549为模型同样证实了这一观点，然而其中的机制尚不清楚。

图3 不同浓度的顺铂、5⁃氟尿嘧啶单药及联合用药处理A549细胞48 h后miR⁃21的表达变化

微小RNA（miRNAs）是一类长度为20～25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA。miR⁃21是microRNA家族中的一个亚型，位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上，是具有自主转录单位的miRNA，并且有高度保守性。目前认为miR⁃21在许多人类癌细胞中都表现为过表达，通过作用于多种靶基因，参与细胞增殖、分化、凋亡，同时与肿瘤生长、侵袭、转移、耐药等密切相关［6⁃9］。Gao等［4］通过miRNA芯片技术检测发现miR⁃21在A549／DDP细胞株中的表达比A549细胞高，并且已经证明miR⁃21过表达可导致细胞对顺铂的敏感性降低。Rossi等［10］发现结肠癌细胞在5⁃氟尿嘧啶的持续暴露下miR⁃21的表达有上调趋势。同时Valeri等［11］研究证明miR⁃21的过表达降低了细胞对5⁃氟尿嘧啶的敏感性。本实验研究发现在顺铂处理后细胞内的miR⁃21表达上调，在5⁃氟尿嘧啶处理A549细胞后miR⁃21也表达增加，顺铂联合5⁃氟尿嘧啶处理后细胞内的miR⁃21的表达亦有所增加，但上调趋势明显低于顺铂单药组，这说明miR⁃21的表达可能与联合用药的机制有某种联系，双药处理后，细胞内对药物敏感性的调控机制被启动，对药物的耐药趋势发生了改变，以致miR⁃21的表达上调，但其中的机制有待进一步研究。

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Differential expression ofm iR⁃21 in the suppression of A549 cells w ith cisp latin and 5⁃fluorouracil

XIAO Xia，WU Jian⁃zhong，MA Rong，CAO Hai⁃xia，FENG Ji⁃feng．Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital，Nanjing 210009，China；LIShu⁃chun．Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin in combination with 5⁃fluorouracil in vitro on the viabili⁃ty，cell cycle andmiR⁃21 expression level of A549 cells.M ethodsThe inhibitory effectof cisplatin，5⁃fluorouracil，cis⁃platin in combination with 5⁃fluorouracil on the viability of A549 cells were tested by CCK⁃8 assay in vitro.The change of cellmorphology was observed with inverted microscope，while cell cycle was assayed by flow cytometry.The expression of miR⁃21 wasmeasured by real⁃time quantitative PCR.ResultsThe growth of A549 cells was inhibited by cisplatin in a dose⁃dependentmanner，as well as 5⁃fluorouracil.The suppression ratio of the combined group treated with cisplatin com⁃bined with 5⁃fluorouracilwas higher than that of the single drug group（P＜0.05）；The change of cellmorphology of combi⁃nation group wasmore apparent than that of themonotherapy group，and more suspension and round cells were observed. Cisplatin arrested A549 cell cycle at Sand G2phase.In 5⁃fluorouracil group，cellswere arrested at Sphase.In combination group，G1phase cells decreased while S／G2phase cells increased.With the increase of the concentration of cisplatin and 5⁃fluorouracil，the expression level ofmiR⁃21 was increased.The expression levelofmiR⁃21 in the combination group was al⁃so increased，but the trend was notobvious as that inmonotherapy group（P＜0.05）.ConclusionsThe viability of A549 cells could be inhibited and the expression level ofmiR⁃21mightbe increased by cisplatin in combination with 5⁃fluoroura⁃cil in vitro.

cisplatin；5⁃fluorouracil；microRNA⁃21；non⁃small cell lung cancer；A549 cells

R 734.2

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.02.009

2013⁃11⁃09）

210009江苏省南京市，南京医科大学附属肿瘤医院，江苏省肿瘤医院肿瘤内科（肖霞，吴建中，马蓉，曹海霞，冯继锋）；210009江苏省南京市，南京工业大学（李树春）

冯继锋，Email：fengjifengx＠sina.cn