c-ski在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

郭晓光，王 琼，朱治键

(1.南充市中心医院病理科，川北医学院第二附属医院；2.川北医学院病理教研室，四川 南充 637000)

食管癌(carcinoma of esophagus)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来对食管癌分子生物学的研究表明，食管癌的形成是细胞生长与增殖调控发生严重紊乱的结果，而癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生、发展和治疗方面都扮演着重要的角色，但确切的发病机制仍未清楚。ski基因作为细胞内的一个原癌基因，具有多种生物活性，参与体内多种病理生理过程。人的c-ski基因属于 ski原癌基因家族，有研究表明它是转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)通路最主要的一个负性调控因子，它和Smad复合物的结合可以干扰 Smad 蛋白的磷酸化过程，然后拮抗TGF-β对正常组织细胞分裂生长的抑制效应[1-2]。

c-ski在食管癌中的研究较少，国内尚未见报道。本研究利用免疫组化及原位杂交方法，检测84例食管鳞癌组织、24例食管上皮内瘤变组织中c-ski的表达情况，结合临床病理各项指标，探讨其在食管鳞癌发生发展过程中的作用，以期寻找食管鳞癌诊断及治疗的新型基因靶点。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

材料：收集2005年1月至2007年12月间川北医学院附属医院病理科确诊的食管鳞癌组织84例，上皮内瘤变组织24例，正常食管组织22例。患者年龄38～74岁，平均年龄56岁；55岁以下27例，55岁及以上57例。肿瘤分化：高分化组29例，中分化组39例，低分化组16例。淋巴结转移：有转移组23例，无转移组61例。根据2009年国际食管癌TNM分期标准：Ⅰ期33例，Ⅱ期39例，Ⅲ期12例。24例上皮内瘤变组织，年龄40～72岁，平均年龄52岁。并对食管鳞癌患者进行了随访，获得62例(74%)随访资料；所选病例均有完整临床资料和病理资料，所有病例均经病理复检核实。另选22例因食管鳞癌行食管切除的上切缘组织(距癌组织大于2 cm，无癌残留)作为对照组。

试剂：浓缩型兔抗人多克隆抗体c-ski，规格1.0 mL，购自北京博奥森生物技术有限公司；c-ski原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。免疫组化二抗试剂盒(SP试剂盒)，二氨基联苯四盐酸(DAB)购自福建迈新生物科技开发公司。

1.2 方法

对3组共130例食管组织作连续切片3张，厚度为3 μm，分别进行c-ski免疫组化染色及原位杂交染色。免疫组化染色采用SP法，原位杂交方法按说明书操作。用已知c-ski蛋白阳性的肺癌组织作为阳性对照，用 PBS 替换一抗做为空白对照。

1.3 结果判断

c-ski蛋白免疫组化染色以在细胞膜/浆内出现棕黄色颗粒为阳性，c-ski mRNA原位杂交染色以在细胞核中出现棕褐色颗粒为阳性。每张切片随机选择 10个高倍视野，分别按照c-ski mRNA，c-ski蛋白阳性细胞数占视野中总细胞数的平均百分比计数，阳性细胞数大于等于10%为阳性(+)，阳性细胞数小于10%为阴性(-)。

1.4 随访

以信函、电话方式对所选病例进行随访，从术后第1天起，术后5年截止，随访60个月。

1.5 统计学分析

采用χ2检验和Spearman相关性分析，以P<0.05为有统计学意义，P<0.01为有高度统计学意义。生存分析采用Kaplan-Meier法，用对数秩检验图表示，以P<0.05具有统计意义。所有统计数据均用SPSS16.0软件分析完成。

2 结果

2.1 c-ski蛋白和c-ski mRNA在正常食管、食管上皮内瘤变、食管鳞癌组织中的表达情况

免疫组织化学结果显示：c-ski蛋白阳性表达在胞膜/胞浆，呈棕黄色颗粒(图1、图2)。c-ski蛋白在正常食管组织，上皮内瘤变组织和食管鳞癌组织中阳性表达率分别为6.67%(6/22)、45.8%(11/24)、70.2%(59/84)，阳性率依次递增，3组之间的差异有高度统计学意义(P<0.01)。原位杂交染色显示：c-ski mRNA的表达阳性物主要位于胞核中，呈棕褐色颗粒状(图3、图4)。在正常食管组织，上皮内瘤变组织，食管鳞癌组织中c-ski mRNA阳性表达率分别为13.6%、62.5%、92.9%，3组之间差异有高度统计学意义(P<0.01)(表1)。

2.2 c-ski蛋白的表达与临床病理特征之间的关系

c-ski蛋白在食管鳞癌中的表达与TNM分期有相关性(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移等均无相关性(表2)。

表1 c-ski mRNA与c-ski蛋白在正常食管上皮，上皮内瘤变，食管鳞癌组织中的表达情况

例数c-ski 蛋白阳性(%)c-ski mRNA阳性(%)食管上皮组织226(27.3)3(13.6)上皮内瘤变组织2411(45.8)15(62.5)食管鳞癌组织8459(70.2)∗78(92.9)#

* χ2=15.186，P<0.01；# χ2=12.113，P<0.01。

表2 c-ski蛋白表达与食管鳞癌患者的临床病理特征的关系

2.3 c-ski蛋白在食管鳞癌组织中的表达与患者五年生存率的关系

共随访食管鳞癌患者62例，c-ski蛋白阳性表达者术后5年生存率为64.1%，c-ski蛋白阴性表达者术后5年生存率为69.6%，二者差异不大。Kaplan-Meier生存曲线显示食管鳞癌组织中c-ski蛋白表达阴性、阳性患者的五年生存时间无明显关系(图5)。

3 讨论

3.1 c-ski在食管鳞癌中的表达情况及与临床病理特征的关系

ski基因是生物细胞内的一个原癌基因，具有多样的生物活性功能，参与了动物体内多种生理和病理过程[3-5]。人c-ski基因属于ski 原癌基因家族，定位于人染色体的lq22-24，有6种不同片段长度的转录子，分别是1.0 kb，2.1 kb，3.0 kb，3.8 kb，4.7 kb和6.0 kb。最近关于c-ski研究认为，c-ski的表达失常与多种肿瘤的癌变相关，如在神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、胃癌及前列腺癌中，c-ski表达均明显升高[6-7]。

本文对84例食管鳞癌组织，24例上皮内瘤变组织和22例正常食管组织做c-ski蛋白的免疫组化染色，对c-ski mRNA进行原位杂交染色，并对c-ski蛋白的表达情况与临床病理特征之间的相关性进行分析。实验结果显示，c-ski及c-ski mRNA在食管癌中的表达明显高于上皮内瘤变组织和食管上皮组织。c-ski蛋白在食管癌中的高表达与肿瘤TNM分期密切相关，该结果与Fukuchi等[8]报道一致，提示c-ski可能是食管癌发生发展过程中的一个有意义的分子事件，可能为食管癌基因靶向治疗提供一个新型的潜在作用靶点。但本研究同时还显示，c-ski蛋白的阳性表达与患者的性别、肿瘤的分级、是否有淋巴结转移及五年的生存时间无明显关系。c-ski在肿瘤中的作用还有很多未知，有很大的研究空间。

3.2 c-ski蛋白表达情况与食管癌患者预后的关系

关于c-ski的表达与食管癌患者预后的相关研究，国内外均未见相关报道。有学者在研究胃癌、乳腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤等恶性肿瘤时发现c-ski的表达与患者的生存时间关系不大。本研究共随访食管鳞癌患者62例，c-ski蛋白阳性表达者与阴性表达者术后5年生存时间无明显差异.这一研究结果与其他作者在胃癌中的研究结果一致[9]。我们认为患者生存时间的长短与多种因素相关，比如个体身体素质，年龄，心理，治疗状况等，而c-ski的表达作为其中的一个因素，对患者的预后起到多大影响，还需要进行更多、更长时间的回访跟踪研究。

【参考文献】

[1] He J，Tegen SB，Krawitz AR，et al．The Transforming activity of Ski and SnoN is dependent on their ability to repress the activity of Smad proteins[J]．J Biol Chem，2003，278(33)：30540-30547

[2] Hiroyuki S，Ken Y，Miki K，et al．c-Ski inhibits the TGF-beta signaling pathway through stabilization of inactive Smad complexes on Smad-binding elements[J]．Oncogene，2004，23(29)：5068-5076

[3] 王 霞，周元国.c-ski原癌基因及其生物学活性[J].国外医学肿瘤学分册，2004，31(suppl.1)：85-89

[4] Koliopanos A，Friess H，di Mola FF，et al．Connective tissue growth factor gene expression alters tumor progression in esophageal cancer[J].World J Surg，2002，26(4)：420-427

[5] Costelli P，Carbo N，Basquets S，et al．Reduced protein degradation rates and low expression of proteolytic systens support skeletal muscle hypertprphy in Tranagenic mice overexpressing the C-Ski oncogene[J]．Cancer Lett，2003，200(2)：153-160

[6] Boone B，Haspeslagh M，Brochez L．Clinical significance of the expression of c-Ski and SnoN，possible mediators in TGF-beta resistance，in primary cutaneous melanoma[J]．J Dermatol Sci，2009，53(1)：26-33

[7] Zhang F，Lundin M，Ristimaki A，et al．Ski-related novel protein N(SnoN)，a negative controller of transforming growth factor-beta signal，is a prognostic marker in estrogen receptor-positive breast carcinomas[J]．Cancer Res，2003，63(16)：5005-5010

[8] Fukuchi M，Nakajima M，Fukai Y，et al．Increased expression of c-ski as a co-reressor in transforming growth factor-beta signaling correlates with progression of esophageal squamous cell carcinoma[J]．Int J Cancer，2004，108(6)：818-824

[9] 潘 申，石 颖，慎睿哲，等.c-ski在胃癌组织中的表达与临床因素相关性分析[J].胃肠病学和肝病学杂志，2010，19(11)：975-977