结肠癌中caspase9表达程度与癌周炎症程度关系的研究

木尔扯尔，文 彬，黄一凡，刘 钧

(1.川北医学院法医系；2.川北医学院附属医院病理科，四川 南充 637000)

以往的研究显示，线粒体凋亡途径的核心因子caspase9在结直肠癌中表达下降[1-4]；但本课题组先前的研究中，用IHC和RT-PCR法研究了大样本人体结肠癌中caspase9蛋白和mRNA的表达，却发现结肠癌中caspase9蛋白、mRNA的表达与正常结肠相比表达并无降低，反而有升高的趋势(另文发表，尚未见刊)。经过仔细分析，发现部分切片的癌周组织中有程度不等的炎细胞浸润现象。会不会是结肠癌周围炎细胞的浸润引起caspase9表达异常升高，从而拮抗肿瘤发生时抑制caspase9表达的作用？查阅文献，发现以下研究与我们的问题相关：如于庆生等[5]发现，大鼠肠黏膜受到缺血-再灌注损伤后，发生炎症的肠黏膜中caspase9等凋亡因子的mRNA显著增多，而用药物控制缺血-再灌注引起的肠黏膜炎症后，caspase9等凋亡因子mRNA又显著减少；王卫等[6]亦发现在高糖刺激下，肾小管上皮NRK-52E细胞株中炎症介质NLRP3(核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族NLRs的成员)的表达明显增高，且凋亡相关因子caspase-3蛋白的表达也随之增高，细胞凋亡率升高；而用SiRNA转染方法抑制NLRP3表达后，细胞凋亡受到明显抑制。另有研究发现，NLRs另一个成员NALP1不仅可与caspase5结合形成炎症复合体，激活caspase1和caspase5及其下游的炎症因子如IL-1β，IL-18和IL-33的前体，促进炎症反应的发展，也可与细胞线粒体凋亡途径的Apaf-1，caspase9相互作用，促进细胞的凋亡[7]。以上这些文献虽然都不是研究肿瘤凋亡与炎症之间关系的直接文献，但证明组织发生炎症后，可引起caspase9表达升高和细胞凋亡增多。基于这些提示，我们研究了caspase9表达程度与肿瘤周围炎细胞浸润程度的关系，以期分析先前我们实验结果与其他研究不符的原因，并初步探讨肿瘤形成后，炎症对肿瘤凋亡的影响作用。

1 材料与方法

1.1 标本

川北医学院附属医院病理科确诊存档的2004年至2006年原发性结肠癌蜡块138例。其中男性89例，女性49例；最小16岁，最大84岁，平均(56.0±13.7)岁，中位年龄57岁。其中管状腺癌109例(78.9%)，黏液腺癌23例(16.7%)，管状腺癌合并黏液腺癌的3例(2.2%)，乳头状腺癌2例(1.4%)，未分化癌1例(0.7%)，未见其他如腺鳞癌、小细胞癌及类癌等组织学类型病例。以上实验标本均未做过术前放化疗，患者均知情同意，符合医学伦理学相关规定。

1.2 免疫组化染色

caspase9兔抗人多克隆浓缩抗体购自福建迈新公司。caspase9蛋白的表达采用EnVision两步法检测，抗体浓度1∶200。结果判定：caspase9棕黄色或棕黑色颗粒主要定位于细胞质，部分可定位于细胞核。根据阳性细胞的百分比对组织切片进行测定划分：0分，无上皮性细胞着色；1分，<25%的上皮性细胞阳性；2分，25%～50%的上皮性细胞阳性；3分，50%～75%的上皮性细胞阳性，4分，>75%的上皮性细胞阳性。着色强度则用以下方法测定：0分，无阳性细胞 ；1分，轻微着色；2分，中度着色；3分，高度着色。将两分数相加，得分在0～7之间。切片观察由2个高年资病理医师单独进行打分，最后取平均分，0～2分为阴性，3分及以上为阳性(3分为﹢，4～5分为﹢﹢，6～7分为﹢﹢﹢)。

1.3 癌周炎症程度的确定

结肠癌癌周的炎症程度确定参照非癌组织的炎症程度判断方法：从炎细胞分布密度，炎细胞组织浸润面积和组织浸润深度三方面综合评估，该工作也由两个高年资的病理医师进行，结果分为无、轻度、中度和重度炎细胞浸润四个等级。结果不一致的重新讨论后确定，最后将结果与免疫组化染色结果综合进行计数统计。

1.4 统计学分析

采用SPASS 13.0进行统计分析，等级资料相关分析用spearman秩相关分析。

2 结果

138例结肠癌中caspase9蛋白表达与癌周炎症程度的相关性分析：以癌周炎症程度将138例结肠癌分成四组： A组为重度炎细胞浸润组(27例)；B组为中度炎细胞浸润组(28例)；C组为轻度炎细胞浸润组(43例)；D组为无炎细胞浸润组(40例)。对癌周炎症程度与癌中caspase9蛋白表达进行spearman相关性分析，结果显示(表1)。癌周炎症程度等级与结肠癌中caspase9的阳性程度表达呈正相关，spearman秩相关系数rs=0.364，P=0.000。

表1 癌周炎症程度与癌中caspase9蛋白表达的spearman相关分析

*R×C 秩相关分析，P<0.01。

3 讨论

结直肠癌的发生与经典wnt通路的异常有极其密切的关系：当wnt通路发生异常时，β-catenin可出现胞质内异常表达[8]，进而可转位入核，激活下游增殖相关调控信号和抑制下游凋亡相关通路的激活，使细胞发生过度增殖，最后导致结肠肿瘤的发生。以caspase9为核心的线粒体凋亡途径正是照wnt通路下游的一个凋亡通路[9]。因此按wnt通路与线粒体凋亡途径理论上的关系，当结肠癌发生后，癌中caspase9表达理应下降，凋亡减少； caspase9蛋白在不同结肠组织的表达也应满足如下的关系：正常结肠>结肠腺瘤>结肠癌。然而我们先前的实验结果却出现了与上述理论相反的结果：caspase9蛋白、mRNA在结肠癌中caspase9表达均高于其在正常结肠组织中表达。

为进一步分析实验结果与理论相悖的原因，我们分析了138例结肠癌中caspase9表达程度与癌周炎症程度的关系。结果显示，癌周炎症程度与结肠癌中caspase9的阳性程度表达呈spearman正相关关系，且有统计学意义；caspase9在炎症程度等级为A、B组结肠癌中的阳性表达(图1)显著高于癌周浸润程度为C、D组结肠癌组中表达(图2)。这些结果提示，结肠癌中caspase9蛋白的表达程度随炎症程度的加剧而升高；但若caspase9在结肠癌中表达上升，会进一步激活以caspase9为核心的细胞线粒体凋亡途径，从而促进癌细胞的凋亡；因此从这个角度来讲，显然癌周炎症对癌患者是有益的，因为其起了抗癌的作用。在临床上也可以见到这样的现象，即癌患者肿瘤组织中炎症越重(非肿瘤中心及坏死引起的炎症)，其手术预后反而较好，可能就与炎症参与抗肿瘤作用有关。然而根据传统的观点，炎症却是导致结肠癌发生发展的重要因素，特别是慢性炎症与结直肠癌的发生有极为密切的关系：在持续炎症的刺激下，正常结肠逐渐发生瘤变产生结肠腺瘤，最后在结肠腺瘤的基础上进一步发展为结肠癌[10]，因此病理学上把结直肠的慢性炎症归为是癌前病变。虽然目前研究炎症与肿瘤发生之间关系的文献主要以炎症如何引起肿瘤发生为主[11]，而对肿瘤生成后，炎症对肿瘤影响作用的研究甚少；但根据本实验结果结合传统的观点[10-11]，结合国内外文献的提示[5-7，12]，笔者推测炎症在肿瘤的不同阶段，可能扮演了不同的角色，早期炎症对肿瘤的发生起促进作用，晚期对肿瘤起抗肿瘤免疫的角色，从而使机体抗肿瘤免疫作用增强，激活了细胞凋亡途径，而caspase9为核心的细胞线粒体凋亡途径就是被激活的其中之一。

但以上观点毕竟只是实验基础上的一种推测，要充分证明结肠癌形成后炎症对结肠癌起抗肿瘤免疫的作用，还需要更深入的实验来证明，这也是我们下一步的实验目标。

【参考文献】

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