上皮性钙黏附蛋白及基质金属蛋白酶-9在皮肤黑色素瘤及色素痣中的表达及意义

杨慧敏，黄一凡，谢贤镛，李祖茂

(川北医学院基础医学院病理学教研室，四川 南充 637000)

黑色素瘤(melanoma)，又称为恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)，是一种能够产生黑色素的高度恶性肿瘤，多见于30岁以上人群，多发于皮肤即皮肤黑色素瘤(cutaneous melanoma，CM)，亦可见于黏膜及脉络膜等处。CM具有高恶性度及高转移率的特点，其发生与过度日晒、紫外线照射、皮肤色素痣等有关。临床上非典型痣及病理上发育异常痣与黑色素瘤的高危险性相关，有文献报道[1]，有10个以上非典型痣的个体发生MM的相对危险度为12(95%，CI 4.4～31)，并与全身痣的数量互为独立危险因素。本研究拟通过免疫组织化学方法观察CM及色素痣中上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达情况，探讨E-cadherin与MMP-9在CM发生发展过程中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例资料 收集川北医学院附属医院病理科2008年至2012年手术切除标本68例，其中CM 48例，色素痣20例(皮内痣及交界痣各10例)，均为福尔马林固定后石蜡包埋标本，所有病例HE染色后经高年资病理诊断医师复诊确认。CM患者中，年龄25～78岁，中位数55岁；男性27例，女性21例；病变位于足部18例，外阴9例，腿部8例，上肢和手部7例，躯干及头面部6例；有明确淋巴结转移者17例(复发和远处转移情况不限)；肿瘤厚度于光镜下直接测量，浸润深度及分型参照相关文献[2]确定；所有病例术前未经放化疗。

1.1.2 主要试剂 即用型兔抗人E-cadherin单克隆抗体、即用型兔抗人MMP-9单克隆抗体、PV-9000免疫组化检测试剂盒及浓缩型DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色法 采用EnVision二步法，按抗体及试剂盒说明书操作，具体如下：石蜡包埋组织块切4 μm厚连续切片，常规脱蜡、水化组织切片；3% H2O2去离子水孵育10 min；E-cadherin检测切片采用1 mM EDTA(pH8.0)高压热修复，MMP-9检测切片采用0.01 M柠檬酸缓冲液(pH6.0)高压热修复；滴加一抗工作液，4 ℃过夜，后PBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂1，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂2，37 ℃孵育20～30 min，PBS冲洗，2 min×3次；应用DAB工作液显色5 min左右，自来水充分冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。用PBS替代一抗做阴性对照，用已知阳性的结肠癌/肝脏组织切片做为E-cadherin/ MMP-9检测的阳性对照。

1.2.2 结果判定 E-cadherin阳性标准为细胞膜/细胞质着色，MMP-9阳性标准为细胞质着色，表示为阳性部位呈均匀颗粒状或线性棕黄色。每张切片随机观察10个高倍镜(400×)视野，对比背景着色观察细胞染色强度及计数阳性细胞数。E-cadherin阳性结果参考江文静等[3]的方法，即先按染色强度计分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；再按阳性细胞所占百分比计分：显示明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色。阴性为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项计分相加所得总分进行结果判定：0～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，>4分为强阳性(++)，即3分及以上则判定为阳性。MMP-9阳性结果参考王连等[4]的方法：先按染色强度计分：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。再按阳性细胞所占的百分比计分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。阳性强度为两种记分之和：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～5分为中等强度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)，即1分及以上则判定为阳性。

1.3 统计学分析

采用SPSS11.5统计软件进行，组间比较采用卡方检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E-cadherin及MMP-9表达情况

CM组织中E-cadherin及MMP-9阳性表达率分别为37.5%(18/48)及79.2%(38/48)；色素痣组织中E-cadherin及MMP-9的阳性表达率分别为85%(17/20)及10%(2/20)[其中交界痣组织中阳性表达率分别为80%(8/10)及20%(2/10)，皮内痣组织中阳性表达率分别为90%(9/10)及0%(0/10)]。E-cadherin及MMP-9在CM与色素痣中表达比较，差异均有统计学意义(χ2值分别为12.752及27.884，P均<0.01)。在两种色素痣中E-cadherin及MMP-9的表达差异无统计学意义，P均>0.05。

2.2 E-cadherin及MMP-9表达与CM病例临床病理特征的关系

E-cadherin和MMP-9的表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者的年龄、性别、肿瘤厚度及分型无关(P>0.05)(表1)。

2.3 E-cadherin及MMP-9在CM中表达的相关性

E-cadherin及MMP-9在CM中的表达呈负相关(r=-0.45，P<0.01)，见表2。

表1 E-cadherin及MMP-9在CM中表达与患者临床病理特征的关系

表2 E-cadherin及MMP-9在CM中表达的相关性

3 讨论

恶性肿瘤转移过程的重要步骤包括细胞外基质和基底膜的降解，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在其中担任了重要的角色。MMPs是一类肽链内切酶，目前发现的有20多种，可降解组织基底膜和细胞外基质的多种蛋白质成分[5]。MMP-9是分子量为92 kDa的明胶酶B，主要由巨噬细胞及某些肿瘤细胞合成分泌，可降解Ⅳ、Ⅴ型胶原等。基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原，因此MMP-9在肿瘤的浸润和转移过程中起着十分重要的作用，其表达增加与肿瘤浸润转移风险的增加呈正相关，这一结论已在对多种恶性肿瘤的研究中得到证实[6-7]。

钙黏附蛋白(cadherin)是一类与Ca2+依赖性细胞间黏附相关的糖蛋白，包括E-、P-、N-cadherin等。E-cadherin是一种穿膜蛋白，在大多数上皮组织中表达，在上皮细胞黏附中发挥重要作用，其下调与多种上皮源性肿瘤转移和预后不良有一定的相关性[8]。

虽然这两种蛋白在恶性肿瘤浸润转移中的作用已在研究中被证实，但其在CM及色素痣中的表达情况却鲜有报道。本实验研究采用免疫组织化学方法，检测48例CM及20例色素痣组织中E-cadherin及MMP-9的表达，结果显示，与色素痣组织相比，MMP-9在CM中表达明显增高，差异具有统计学意义，这一结果与张娟等[9]的研究结果相一致，提示MMP-9可能在CM的发生发展特别是色素痣恶性演变中起重要作用。纪长伟等[10]发现，在黑色素瘤荷瘤小鼠肿瘤病灶中E-cadherin的表达随发病时间推移下调，而本研究结果提示E-cadherin在CM中表达较色素痣中有明显降低，提示E-cadherin的表达缺失可能与CM浸润进展有关。

有关E-cadherin和MMP-9在肿瘤中特别是在CM中表达的关系文献报道很少，Akdeniz等[11]研究发现，随喉鳞癌分化程度降低，MMP-9的表达增高，而E-cadherin表达则降低，且E-cadherin表达降低与淋巴结转移程度有关。在E-cadherin和MMP-9与CM患者临床病理特征的关系研究中发现：E-cadherin和MMP-9在CM中的表达变化与肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关，但与其余临床病理特征如年龄、性别等关系无统计学意义。浸润深度与淋巴结转移是影响CM预后的重要因素，提示E-cadherin表达下调及MMP-9表达增高或可作为判断CM预后不良的指标。对E-cadherin和MMP-9在CM中的相关性分析显示二者表达具有负相关性，提示MMP-9表达上调伴随有E-cadherin表达下调，可能与E-cadherin下调致使肿瘤细胞间黏附松散，便于脱离原发灶往间质浸润及远处转移有关，二者之间是否存在拮抗作用及其作用机制有待进一步研究。

综上所述，通过本实验研究我们认为MMP-9及E-cadherin表达与黑色素瘤发生、发展有关。MMP-9上调可能与E-cadherin下调共同促进了黑色素瘤的浸润及淋巴结转移，临床病理检测CM组织中E-cadherin及MMP-9的表达可能对肿瘤的浸润及淋巴道转移风险高低起到预测作用。

【参考文献】

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[2] 刘彤华.诊断病理学[M].第3版，北京：人民卫生出版社，2013.1105-1107

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[4] 王 连，张 煦，王 玲.结直肠癌中 WISP-1 和 MMP-2 的表达及临床意义[J].临床与实验病理学杂志，2012，28(11)：1246-1249

[5] Klein T，Bischoff R．Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases[J]．Amino Acids，2011，41(2)：271-290

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[9] 张 娟，陈旻静，王大伟，等.组织蛋白酶D和基质金属蛋白酶-9在皮肤恶性黑色素瘤中的表达[J].第三军医大学学报，2012，34(10)：1002-1005

[10] 纪长伟，贾立敏，倪秀芹，等.E-cadherin、MCP-1和MIP-1β在B16黑色素瘤荷瘤鼠中的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2008，18(21)：3103-3106

[11] Akdeniz O，Akduman D，Haksever M，et al．Relationships between clinical behavior of laryngeal squamous cell carcinomas and expression of VEGF，MMP-9 and E-cadherin[J].Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(9)：5301-5310