诱导多能性干细胞在心脏疾病领域的研究和应用

王帅飞，王 军，郎希龙，张 浩

·综 述·

诱导多能性干细胞在心脏疾病领域的研究和应用

王帅飞，王 军，郎希龙，张 浩

诱导多能性干细胞；细胞分化；细胞移植；疾病模型；药物筛选；生物起搏器

诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是一种类似于胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）的、具有自主增殖和分化能力的多能性干细胞。iPSCs可以由各种不同动物的不同体细胞重编程转化而来，能增殖并分化成各种体细胞，其中包括具有收缩和兴奋功能的心肌细胞。截止目前，iPSCs分化的心肌细胞主要用于以下几个方面：通过细胞移植治疗缺血性心肌病及心肌梗死；在体外建立遗传性心脏病模型，研究其发病机制；检测药物心脏毒性，筛选患者特异性个体化药物；构建心脏生物起搏器。

iPSCs具有类似于ESCs的全能性，并能自主增殖和分化，可以由患者的体细胞重编程转化获取，避免了ESCs应用的社会伦理问题和移植后免疫排斥反应的发生，因而为干细胞生物学和临床再生／修复医学提供了新的方向［1］。本文主要论述iPSCs分化为心肌细胞的相关研究及其在心脏疾病领域的研究和应用。

1 iPSCs

1.1 iPSCs的概念 2006年日本科学家Yamana⁃ka［2］等通过逆转录病毒载体将多能性相关因子Oct4、Sox2、Klf4和c－Myc转入小鼠成纤维细胞，产生了形态、生长特性与ESCs相似的细胞，并能自主增殖、分化为拟胚体（EB），证明其具有多向分化的潜能。这种将体细胞重编程产生的具有多向分化潜能的细胞被称为iPSCs，这项技术被称作iPSC技术。不久，Yu等［3］将Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转入人的体细胞，产生了类似人的ESCs的人hiPSCs。

1.2 iPSCs技术的发展 利用逆转录病毒能够将多能性相关因子导入体细胞使其重编程为iPSCs，但是转化效率极低。近期研究发现，维生素C［4］、组蛋白去乙酰酶抑制物（如丙戊酸）、TGFβ受体阻滞剂等可以提高iPSCs生成的效率［5－6］。此外，逆转录病毒基因可以整合到宿主基因组，重编程因子c－Myc为原癌基因，使得肿瘤形成风险增大［7］。为了减少肿瘤形成风险，目前多采用无c－Myc重编程技术［8］，应用非整合性的腺病毒载体或者直接向靶细胞导入重编程蛋白［9－10］。

2 iPSCs定向分化为心肌细胞的相关研究

iPSCs可自动分化为EB，出现收缩性心肌细胞［11］。研究证实，分化的心肌细胞（iPSCs－CMs）的分子结构、功能特性与早期心肌细胞类似，且具有分裂增殖能力［12］。电生理研究证实，iPSCs－CMs表现出心室样、心房样、窦房结样动作电位［13］，且表达典型的心肌细胞离子通道。iPSCs－CMs对神经激素类刺激物极为敏感［14］，加入异丙肾上腺素可以见到动作电位频率明显增加，而加入钠通道阻滞剂利多卡因、L－型钙通道阻滞剂硝苯地平、钾通道阻滞剂E4031后动作电位频率则明显减低。针对iPSCs分化效率低，科研人员尝试加入内胚层分泌的促心肌生成因子和TGF－β来提高心肌分化效率。研究发现，活化素A、骨形态发生蛋白4／2、碱性成纤维细胞生长因子、Wnt抑制剂等加入培养基能有效提高分化效率［15］。

3 iPSCs在心脏病领域的应用

以上研究使得iPSCs为心脏再生／修复医学和心脏疾病的研究提供了新的方向，这些应用研究包括：通过细胞移植治疗缺血性心肌病及心肌梗死；在体外建立遗传性心脏病模型，研究发病机制；检测药物心脏毒性，筛选患者特异性个体化药物以及心脏生物起搏器的构建等（图1）。

图1 iPSC细胞在心脏病领域的应用

3.1 缺血性心肌病的治疗 2009年，Nelson［16］等将鼠源未分化的iPSCs和成纤维细胞分别移植入急性心肌梗死的小鼠心肌内，术后行心脏彩超检查显示，iPSCs组在第一周后心脏射血分数明显较对照组好，这种趋势一直维持到第4周；iPSCs组室壁基本正常，而对照组在第4周左室前壁变薄、心尖部有室壁瘤形成；iPSCs组左室舒张末内径（LVDd）和QT离散度明显较对照组减小；组织活检也显示iPSCs组心脏体积总体较对照组小。另外，研究中虽然发现将未分化的iPSCs注入免疫缺陷心肌梗死鼠后，可以在梗死心肌和周围逐渐形成肿瘤，但是在免疫功能正常的鼠中观察8周未见肿瘤形成，这提示免疫功能正常情况下可以提供一个iPSCs定向向心肌分化的微环境。2011年，Mauritz［17］等报道，iPSCs来源的Flk－1＋细胞无论在体内还是在体外，均可以分化为心肌细胞，将iPSCs－Flk1＋细胞移植入急性心肌梗死的小鼠体内，可以明显改善心脏功能和心脏重构。

2013年，Zhang［18］等报道，将猪未分化iPSCs移植到猪心梗区域，与对照组相比，血管再生明显增多，血管内皮生长因子及CX43增多，而神经生长因子减少，交感神经重塑减少，氧化应激明显改善，炎症反应明显减轻，通过电刺激诱导室性心律失常也明显减少，从而证实了iPSCs细胞移植能预防心梗后室性心律失常发生。2013年，Yan［19］等将iPSCs和iPSCs－CMs共同植入糖尿病鼠心肌，发现可减轻氧化应激损伤（促氧化表达减少，抗氧化剂如过氧化氢酶和MnSOD表达上升）及相关的细胞凋亡和纤维化（Akt上调，ERK1／2下调），减缓不良心肌重塑，超声心动图提示心脏功能提升。2013年，Yama⁃da［20］报道，将iPSCs植入鼠心梗区域，可以提高左室传导性及收缩性能，减少瘢痕形成，逆转结构重塑，减缓心肌失代偿，有望使缺血心肌异常室壁运动重新同步化。但是iPSCs能否用于临床治疗心肌梗死的患者，还需要更多的动物实验尤其大动物实验来进行证实，以进一步证明iPSCs用于细胞移植的有效性和安全性。

3.2 遗传性心脏病模型的建立及发病机制研究iPSCs技术可以取遗传性心脏病患者自身的体细胞重编程为iPSCs，诱导定向分化为iPSCs－CMs，在体外建立遗传性心脏病患者的疾病细胞模型，从细胞水平研究其发病机制，筛选特异性药物，尝试通过基因修饰探索基因治疗方案。Moretti［21］等取1型长QT综合征（LQTS）患者皮肤成纤维细胞重编程并诱导分化为iPSCs－CMs，发现细胞仍然保留有1型LQTS的基因型（常染色体错义突变R19OQ），与正常对照组相比，细胞动作电位时程明显延长，对儿茶酚胺导致的心动过速易感性增加，而用β肾上腺素受体阻滞剂则可以减轻这种变化。2011年，Itzha⁃ki［22］等取2型LQTS（KCNH2基因上A614V点突变导致）患者的体细胞转化为iPSCs－CMs，发现其动作电位时程明显延长，而这种延长主要是由于心脏快速延迟整流钾电流（Ikr）显著减少导致，而且这种细胞显示出明显的致心律失常性，主要表现为早期后除极和诱发性的心律失常，这与患者的临床特征相吻合。2013年，Belin［23］等获取2型LQTS患者的体细胞转化为iPSCs－CMs，通过对突变位点准确的基因纠正，使 Ikr电流和动作电位时程恢复正常。2013年，Ma［24］等取3型LQTS（SCN5A突变）患者的体细胞转化为iPSCs－CMs建立疾病模型，与正常组对照发现，其动作电位明显延长，TTX敏感钠通道增加，动作电位平台期钠通道难失活且易复活，利用钠通道阻滞剂美西律可逆转此病理过程。

2013年，Caspi［25］等获取致心律失常右室心肌病（ARVC）患者的体细胞转化为iPSCs－CMs，建立疾病模型研究ARVC发病机制（PKP2突变），实时（聚合酶链反应，PCR）发现PKP2表达显著下降，免疫染色发现桥粒蛋白及CX43表达下降，电生理发现场电位上升时间延长，电子显微镜观察到增宽和扭曲的桥粒及胞内脂滴聚集，这与促脂生成转录因子PPAR－γ上调有关，发现了应用糖原合成激酶GSK－3β阻滞剂可以抑制此病理过程。2013年，Zhang［26］等取儿茶酚胺依赖多形性室速（CPVT，兰尼碱受体RyR2点突变导致）患者的体细胞转化为iPSCs－CMs建立疾病模型，与正常组对照发现其发病与钙信号通路改变有关：钙信号通路单一，胞内钙储备较低，（钙诱导钙释放，CICR）获得较高，对肾上腺素能调节敏感。iPSCs技术在体外建立遗传性心脏病患者的疾病细胞模型，为疾病发病机制研究、药物测试及筛选、新的治疗方法的探索提供了一个更为方便、有效的平台。

3.3 药物心脏毒性检测及药物筛选 心血管疾病药物往往具有副作用，主要表现为心脏毒性和致心律失常作用，而且心脏病患者对药物的副作用更为敏感，因而可以用iPSCs－CMs在体外建立药物检测模型，较当前应用永生细胞系和动物模型测试药物的敏感性和特异性更高。Ma［27］等利用3型LQTS患者的iPSCs－CMs在体外构建了三维丝状心肌组织用来研究其收缩异常机制，并检测一系列药物的心脏毒性。Navarrete［28］等利用hiPSCs－CMs和低阻抗微电极阵列检测了hERG钾通道阻滞剂（如索他洛尔、奎尼丁）的致心率失常作用（后除极化提前和异位搏动），较当前的永生细胞系／动物模型更敏感有效，能准确鉴别假阳性和假阴性hERG阻滞剂。Guo［29］等利用88种药物和30种内源性分子对hiP⁃SCs－CMs节律性和搏动频率的影响，建立了人心肌细胞失节律风险（hCAR）模型，更有效地评价药物的致心律失常作用以及尖端扭转型心律失常、LQTS的发生风险。此外，心血管疾病药物尤其是抗心律失常药物往往存在异质性，个体差异较大，对于心律失常患者而言，同一种药物，并不能取得相同疗效，而源自患者的iPSCs－CMs具有其特异性，可以针对个体进行药物筛选。但是目前尚不能肯定人的iP⁃SCs－CMs与患者体内心肌细胞对药物的反应是否一致。

3.4 生物心脏起搏器的构建 电生理检测发现iP⁃SCs－CMs表现室性、房性、结性动作电位，说明其中含有窦房结样起搏细胞，具有构建生物起搏器的潜能。2012年，Mandel［30］等对人毛囊细胞源iPSCs－CMs连续15天行细胞外电描记，进行非线性动态分析发现，iPSCs－CMs的搏动与窦房结细胞相似，具有搏动频率变异性（BRV），搏动频率－时间关系呈幂次分布（Power－Law Behavior），对肾上腺素能／胆碱能刺激物反应敏感，证实了hiPSCs－CMs具有生物起搏潜能，但是搏动平均频率过慢（39～70 bpm）。Kuzmenkin［31］等发现，尽管iPSCs向心血管系统定向分化时可以分化为心房肌、心室肌、血管以及传导系统的细胞，但是大部分分化而来的细胞（80%～90%）还是表现为心室肌细胞样的动作电位。因此，诱导iPSCs尽可能向结样细胞分化以获得较高纯度的起搏细胞成为生物起搏亟需解决的问题。Jiang［32］等发现iPSCs中钙激活钾通道（SKCa）表达较低，Kleger［33］等发现应用SKCa激活剂可以促进此通道活化，激活Ras－Mek－Erk信号通路，有助于iPSCs向起搏细胞分化。Zhu［34］等发现神经调节蛋白1β／表皮生长因子受体（NRG－1β／ErbB）信号通路调节hESCs－CMs中结样心肌细胞与工作样心肌细胞的比例，通过抑制该信号通路有利于hESCs向起搏细胞分化。当然，利用起搏细胞特异性表面标记从分化心肌细胞中进一步筛选起搏细胞也是一种方法。然而iPSCs来源的起搏细胞其起搏频率尚无法达到临床应用的水平，通过对其进行进一步的基因修饰（如导入起搏基因或者缝隙连接蛋白Cx45）有望提高其起搏效率。

4 前 景

短短几年，iPSCs技术取得了巨大发展，其在心脏疾病研究、治疗方面也取得了明显进步。目前存在的主要问题是iPSCs的重编程机制尚未完全阐明、重编程及诱导分化技术尚缺少统一的标准及其远期的安全性问题［35］。尽管如此，iPSCs技术为再生／修复医学提供了一条有效可行的道路，必将促进再生／修复医学的快速发展。在心脏疾病领域，尽管iPSCs－CMs的应用研究尚处在起步阶段，但现有研究已经表明这一技术在心脏疾病的治疗中具有非常光明的应用前景，为未来心脏疾病的治疗开启了全新的研究方向。

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2014⁃06⁃28）

2014⁃06⁃30）

10.13498／j.cnki.chin.j.ecc.2014.03.19

国家自然科学基金面上项目（81271707，81371692）

200433上海，第二军医大学长海医院胸心外科

张 浩，E－mail：dr.zhghao＠gmail.com