对法医学相关的DYS549、DYS527和DYS459基因座在男性不育症人群中的缺失、重复调查

王跃力，叶峻杰，李宗芳，郑水，马丽，郭海，杨丽娟，程宝文

1. 成都军区昆明总医院，昆明 650032；

2. 云南省人口和计划生育科学技术研究所司法鉴定中心，云南省生育调节与少数民族优生重点实验室，昆明650021；

3. 昆明医科大学第一附属医院，昆明650021；

4. 云南省公安厅，昆明650228

2. Key Laboratory for Fertility Regulation and Birth Health of Minority Nationalities of Yunnan Province, Judicial Expertise Centre, Yunnan Population and Family Planning Research Institute, Kunming 650021, China;

3. TheFirst Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650021, China;

4. Department of Public Security of Yunnan Province, Kunming 650228, China

人类Y染色体短串联重复(Y-short tandem repeat,Y-STR)作为一个特殊的遗传标记以其独特的优势在法医个体识别和家系研究中发挥着重要作用。目前已经报道并命名的 Y-STR位点已经达到 300多个，SWGDAM(The US Scientific Working Group on DNA Analysis Methods) 发布的 11个“核心”STR基因座[1]被广泛应用在男性个体识别的商业化试剂盒中。除此之外，为了增强Y-STR的鉴别能力，单拷贝基因座DYS549和两个双拷贝基因座DYS527、DYS459已广泛应用于法医学鉴定[2]。在男性不育患者中，Y染色体无精症因子区域(Azoospermia factor，AZF)存在较高的微缺失发生率。位于AZF区的DYS549、DYS527、DYS459基因座在男性不育人群中很有可能表现出等位基因缺失或重复的特殊基因型，DNA检验人员无法判断特殊基因型是由于实验结果偏差(样本DNA降解或扩增失败)还是实验对象本身遗传多态造成的。因此，这些特殊基因型会对应用Y-STR进行个体识别的结果产生干扰。DYS549位于AZFb区域(sY108-sY135)，在Y染色体上的物理位置为19.98 Mb；两个双拷贝基因座DYS527、DYS459位于AZFc区域(sY142-sY1201)，在 Y染色体上的物理位置分别为24.29 Mb(反向位置：26.49 Mb)和24.49 Mb(反向位置：26.29 Mb)(3个基因座的资料可以在 UCSC Genome Browser基因组数据库(http://genome.ucsc.edu/)中查到)。本研究应用 14 Y-STR的复合扩增体系(DYS481、DYS576、DYS570、DYS527、DYS459、DYS549、DYS444、DYS449、DYS508、DYS552、DYS522、DYS446、DYS607和DYS627)对无精症和严重少精的男性不育人群进行扫描，研究位于AZFb区的DYS549和AZFc区的DYS527、DYS459的多态性；应用STS位点确认AZFa、AZFb、AZFc片段的缺失和DAZ、CDY1基因拷贝数检测来确认AZFc区片段的缺失和部分重复，由此确认男性不育人群中特殊基因型的存在。

1 材料和方法

1.1 实验样本

非梗阻性无精症、严重少精子症(精子浓度：＜5×106/mL)患者236例，先天性双侧输精管缺如患者4例，共 240例男性不育症患者外周抗凝血标本。病例筛选标准为[3]：男性学和实验室检查排除促性腺激素不足性性腺功能减退症；细胞染色体核型正常；排除再发感染性梗阻性无精症和严重少精子症。在病理筛查过程中，精液常规检测采用世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册(WHO，1999)[4]标准。所有患者均签署了知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

采用 QIAamp®DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden,Germany)微量DNA提取试剂盒，按照说明书提取基因组DNA。

1.2.2 AZF微缺失的STS检测

根据《欧洲Y染色体微缺失分子诊断指南2004版本》推荐的AZF微缺失STS位点[5]，选取6个STS位点(AZFa：sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc：sY254、sY255)进行AZF缺失分析。以Y染色体性别决定基因(Sex-determining region on the Y chromosome,SRY)为男性内对照，正常男性DNA为阳性对照，正常女性DNA为阴性对照，去离子水为空白对照，采用本实验室建立的改良多重 PCR技术[6]对样本全基因组DNA进行扩增。扩增反应分为两组：A组扩增SRY、sY254、sY127和sY86标记所在 DNA片段；B组扩增 SRY、sY134、sY84和sY255标记所在DNA片段。取10 μL PCR扩增产物，经 3%琼脂糖凝胶电泳检测AZF不同的缺失类型。引物序列及反应条件参考文献[6]。

1.2.3 QF-PCR扩增

14个Y-STR基因座的引物设计和多重PCR反应体系参照 Hanson的方法进行[2]，荧光引物由Invitrogen公司合成。反应体系的总体积为 10 μL，包括：PCR Reaction Mix 4 μL，Primer Set 2 μL，GoldTaqDNA 聚合酶(5 U/μL)0.4 μL，模板 DNA 0.5～l ng，去离子水补足。反应条件：95℃ 11 min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min，28 个循环；60℃ 60 min。PCR产物在ABI 310遗传分析仪上进行毛细管电泳，应用 ABI GeneScan™-500 LIZ®size standard (Applied Biosystems)做为内参标准，GenemapperID V3.2软件收集数据并分析结果。

1.2.4 DAZ、CDY1基因拷贝数的检测

以DAZL基因(位于常染色体的DAZ同源基因，2个拷贝)作为内参基因，使用引物 o1130(5'-ttaagtactactgtagacac-3')和o1313(5'-gtttcttgtataatgtagaagagtagagc-3')[7]扩增DAZ(214 bp)和DAZL(217 bp)基因；以CDY2基因(位于Y染色体的CDY1同源基因，2个拷贝)作为内参基因，使用引物 o953a(5'-tattgagacccttgcacctg-3')和o1023(5'-gtttcttggagtttcccttctgtcacc-3')[7]扩增CDY1(134 bp)和CDY2(137 bp)基因。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 40 s，28 个循环；60℃ 60 min。o1130和o953a引物的5'端标记FAM荧光，PCR产物在ABI 310遗传分析仪上进行毛细管电泳，应用ABI GeneScan™- 500 LIZ®size standard (Applied Biosystems)作为内参标准，DAZ和CDY1的基因拷贝数分别通过与DAZL和CDY2峰面积的大小比较来确定。

2 结果与分析

2.1 Y染色体微缺失

图1 AZF微缺失多重PCR产物电泳结果

对 236例非梗阻性无精症、严重少精子症和 4例先天性输精管缺失患者的6个STS位点进行检测，共发现40例AZF缺失，缺失比例为16.67%。其中2例AZFa缺失，缺失比例为5%；2例AZFb缺失，缺失比例为5%；30例AZFc缺失，缺失比例为75%；AZFb+c的缺失类型有6例，缺失比例为15%。考虑其患病类型，非梗阻性无精症患者存在13例AZFc缺失、6例AZFb+c缺失、2例AZFa缺失和1例AZFb缺失；严重少精子症患者存在 17例AZFc缺失、1例AZFb缺失；先天性输精管缺如患者未发现AZF缺失。AZF微缺失的STS检测琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.2 14 Y-STR体系等位基因缺失

扫描14 Y-STR基因座发现38例STR位点出现缺失，AZFc缺失类型发现DYS527、DYS459缺失，AZFb+c缺失类型发现DYS549、DYS527、DYS459缺失，2例AZFb缺失类型区域内缺失DYS549，2例AZFa缺失和 4例先天性输精管缺如患者未发现STR位点缺失(表 1)。AZFb+c微缺失病例的基因分型结果见图2。除了DYS549、DYS527、DYS459外，其他位点在男性不育人群中未见缺失。

2.3 DAZ、CDY1基因拷贝数

位于AZFc区的DAZ/CDY1基因正常拷贝数为4/2。应用基因拷贝数检测可以证实不育症患者中AZFc区Y-STR位点的缺失和复制(表1)。本研究发现，36例AZFc缺失和AZFb+c的患者DAZ/CDY1基因拷贝数为0/0，与DYS527、DYS459缺失结果相符；10例AZFc部分片段复制的患者DAZ/CDY1基因拷贝数为 6/3，占所调查不育人群的 4.17%。14个Y-STR基因座筛查电泳图谱(图3)显示DYS527、DYS459各为3个拷贝。

表1 Y-STR基因座在不育患者中的缺失/重复类型

图2 AZFb+c缺失的14 Y-STR基因座电泳结果

图 3 男性不育病例中 DYS459、DYS527拷贝数重复的电泳结果

3 讨 论

作为人类仅有的单倍遗传的染色体，Y染色体的非重组区(No-recombining region of the Y, NRY)存在着大量高度同源的重复序列，其频发的染色体内非等位性重组(Non-allelic homologous recombination, NAHR)使Y染色体具备了高变异率的特点，导致 Y染色体出现缺失、重复等结构上的变化[8,9]。Vogt等[10]将AZF区域划分为3个互相隔离的亚区，分别为AZFa、AZFb和AZFc，Y染色体长臂与精子发生相关的AZF区微缺失可以造成生精障碍，是造成男性不育的原因之一，不同区域的AZF缺失对应不同的临床不育表型如无精和严重少精症。约1/4000的男性因AZFc缺失而导致不育[11]；AZFa缺失则很少见，其发生率约为1/100 000[9]；AZFb在人群中的缺失频率介于AZFc和AZFa之间[11]。在本文所调查的不育人群中，AZFc、AZFb、AZFb+c、AZFa缺失比率分别为75%、5%、15%、5%，与付莉等[12]报道的中国人群AZF缺失比率相近，而与白种人的缺失类型之间存在差异[13]。AZFc区部分重复在台湾汉族和云南彝族人群中与男性不育相关[14,15]，这些男性的临床表型表现为无精症或严重少精症。

由于Y染色体的NRY区不与X染色体核酸结构在减数分裂中发生重组，除了基因突变以外，其序列在父性家系中能够稳定地一代又一代传递下去，因此在法医学上Y-STR在个体识别中的鉴别能力决定于构成单体型的 Y-STR基因座数量，应用的Y-STR基因座数量越多，鉴别效能越高。自20世纪90年代以来，商业化Y-STR应用到法医鉴定的数量已经从9个发展到17个基因座[16]。本文应用的14个Y-STR位点是17个商业化Y-STR基因座以外的补充。同时，在男性个体识别的检验中已发现两个无关个体的17个商业化Y-STR基因座同时匹配现象，因此筛选更多的Y-STR基因座，提高单体型鉴别效能，是法医学的一个研究热点。在家系分析中，14个Y-STR中的单拷贝基因座DYS549在北京汉族和潮汕汉族群体中的基因多样性(Gene diversity，GD)为0.63、0.64[17,18]；双拷贝基因座DYS527在广东汉族中的GD为0.92[19]；另一个双拷贝基因座DYS459在武汉汉族中的GD为0.6[20]；美国人群DYS549、DYS527、DYS459的 GD 为 0.72、0.92、0.75[2]。这些数据说明3个基因座在人类学研究中具有相当高的应用价值。

本课题组在前期研究中，采用商业化的 17个Y-STR基因座 Y-filerTM试剂盒(DYS19、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS385a/b、DYS448、DYS456、DYS458、DYS635和Y-GATA-H4)对无精和严重少精的男性不育人群进行了扫描，在 8个Y-STR基因座发现无效等位基因，其中AZFa缺失的病例发现DYS438、DYS439、DYS437、DYS389I和DYS389II等位基因缺失；AZFb缺失的病例发现DYS392、DYS385a/b等位基因缺失；AZFc缺失的病例发现DYS448等位基因缺失[21]。本研究结果显示，位于AZFb区的DYS549和AZFc区的DYS527、DYS459表现出结构多态性，同样表现为因男性不育个体 Y染色体微缺失导致的无效等位基因现象[18]。AZFc和AZFb区(包括AZFb+c)在中国Y染色体微缺失人群中缺失比率较大，如果男性当事者是由于遗传缺陷导致的无精症和严重少精症患者时，应用DYS549、DYS527和DYS459进行法医学或家系分析可能会碰到困难的解释问题。DAZ/CDY1基因拷贝数检测发现DYS527、DYS459两个双拷贝基因为多拷贝变化。一方面DAZ/CDY1基因拷贝数为0验证了DYS527、DYS459无效等位基因的存在，另一方面DAZ/CDY1基因的多拷贝及3个样本特殊的基因型(图3)证明了DYS527、DYS459基因重复，这些变化是由于AZFc区再发的染色体重组形成的而不是实验偏差。AZFc部分复制的发生频率因不同的种族背景而不同，其作为一种有效的工具应用父系和人类进化的研究[22]。但这种多态性会给法医 DNA检验的判读增加难度。本研究发现3个Y-STR基因座在男性不育人群中存在特殊基因型，对个体识别和家系分析中出现的 DNA检验异常结果提供了合理的解释。

由于AZFc缺失的临床表型呈多样化，常见于无精和严重少精症患者，也可见于精子数量正常的男性[9]，并且文献报道AZFc完全缺失的严重少精症患者也可能生育后代[21]，所以当Y-STR检验出现异常基因型时，鉴定者应考虑当事人的生殖实验参数。最新的23个Y-STR位点试剂盒仍然包含DYS549[16]，King等[11]建议商业化法医学试剂盒的设计尽量避开AZF区，以避免因临床不育症涉及到的DNA实验问题。由于男性不育症相关的Y-STR多态性会给法医 DNA检验的判读增加难度，本研究阐明DYS549、DYS527和DYS459在男性不育人群中的异质性，在法医 DNA鉴定中可以更好地完善 Y-STR数据库和提高STR数据的解释能力。在家系分析中，Y-STR基因座的选择同样要避开AZF区，避免因遗传病涉及到的个人隐私问题。

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