丹参酮ⅡA对局灶性脑缺血大鼠急性期脑保护作用的相关研究

刘玲玲，刘红，尹君玲，陈惠英，刘晓蕾，焦清海，武一平

缺血性脑血管病急性期细胞启动多种防御机制[1-2]以保护神经元免受缺血性损伤。目前已知一些转录因子与神经细胞的存活相关，其中最重要的是环腺苷酸反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein，CREB）家族，许多细胞外刺激均能够通过激活细胞内的信号转导通路将信号由胞膜传到细胞核内，激活CREB，使其磷酸化，成为磷酸化CREB（phospho-CREB，p-CREB）。它的基因产物调节着神经元在应激性损伤后的再生、存活和修复[3]。CREB活性调节转导子[4]（transducers of regulated CREB，TORCs）是新发现的一类强有力的CREB的共激活因子，TORC1是其中唯一一个在脑中高表达的亚型，近年来，TORC1对CREB-CRE通路的调控作用已成为研究的热点之一[5-6]。丹参酮ⅡA（Tanshinone IIA，TSA）是临床上常用的中草药丹参的一种有效成分，通过TSA的应用，观察其对脑梗死后急性期的脑保护作用及对TORC1和p-CREB表达的影响，从而探讨TSA与CREB-CRE通路之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体重250～300 g，由河北医科大学基础医学院动物实验中心提供。

1.2 主要仪器和试剂 凝胶扫描分析系统（美国Syngene公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司），2，3，5-三苯基四唑氮红（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美国Sigma公司），兔抗大鼠TORC1单克隆抗体（美国Cell Signaling公司），兔抗大鼠p-CREB单克隆抗体（美国Cell Signaling公司），荧光标记羊抗兔二抗（深圳Rockland公司），TSA（中国西安Huike植物开发有限公司），蛋白提取试剂盒（北京普利莱公司），TSA溶液（用0.9%的生理盐水配制，浓度为20 mg/ml和10 mg/ml两种）。

1.3 分组、模型制备及药物处理 ①分组：将48只大鼠随机分为假手术组、对照组、大剂量TSA组和小剂量TSA组，每组12只。②模型制备：参照Longa等[7-9]的线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。以10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔麻醉，碘伏消毒，颈部正中切口分离结扎右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，颈外动脉近心端备线，用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，在颈总动脉分叉处剪0.2 mm的切口，插入直径0.2 mm的尼龙线沿颈内动脉入颅，进线长度约距颈总动脉分叉处（18.5±0.5）mm，遇阻即止，线栓正好插至颅内的大脑前动脉，阻断大脑中动脉的所有血供来源。固定线栓，缝合皮下组织和皮肤。假手术组除不在颈内动脉插入线栓外，其余步骤与另3组均相同。③药物处理：术后所有大鼠的药物均采用腹腔注射。大剂量TSA组根据大鼠体重注射TSA-H，剂量为20 mg/kg；小剂量TSA组注射TSA-L时用医用生理盐水原药稀释一倍，注射剂量为10 mg/kg；假手术组和对照组注射等量的生理盐水。

1.4 神经功能评分 大鼠在麻醉刚醒时，采用以Longa评分改良6分法[7]进行评分：0分-没有神经功能缺损；1分-大鼠对侧（瘫痪侧）前肢不能完全伸展；2分-对侧（瘫痪侧）前肢不能伸展；3分-稍往对侧（瘫痪侧）转圈（转大圈）；4分-向对侧（瘫痪侧）明显转圈（转小圈）；5分-行走时大鼠向对侧（瘫痪侧）倾倒。除假手术组均选取2～5分作为成功模型，造模不成功组补充大鼠。

1.5 脑梗死体积百分比测定 每组取6只大鼠进行脑梗死体积测定。大鼠在造模成功后24 h，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，称质量后将脑组织行冠状切片。然后迅速将脑片置5 ml含有2%TTC的磷酸缓冲溶液中，37℃避光温孵30 min，经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而脑梗死部分呈白色，且界限分明。脑梗死体积测算方法[10]，总梗死体积=总梗死面积×脑片的厚度，水肿修正后梗死体积=对侧半球梗死体积－（损伤侧半球体积－损伤侧半球梗死体积），梗死体积百分比（%）=修正后梗死体积/对侧半球体积。

1.6 应用Western blotting检测TORC1和p-CREB的表达 每组分别取大鼠6只（包括用于萃取顶叶梗死区脑神经细胞p-CREB和TORC1核蛋白的3只，萃取TORC1细胞总蛋白的3只）。

1.6.1 标本的采集 各组大鼠在规定时间的治疗观察完成后，麻醉后取出脑组织，在冰盘上剥离大脑中动脉闭塞侧，放于－70℃冰箱内备用。

1.6.2 蛋白提取[8-9]按照总蛋白提取试剂盒说明操作提取测定总蛋白。取50 mg脑组织，转移到离心管中，加入500 μl裂解液，5 μl蛋白磷酸酶抑制剂混合物，组织剪剪碎组织，后用高速机械匀浆器破碎组织；取0.5 ml组织匀浆液转移至1.5 ml离心管中，弃去剩余的组织匀浆液，加入2倍体积的抽提试剂及10 μl蛋白磷酸酶抑制剂混合物充分混匀，后4℃静置10 min，偶尔晃动；10 000 g 4℃离心10 min，溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜，吸除上层液体，后用吸头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体，蛋白膜将附着于离心管壁上。加入2%十二烷基硫酸钠水溶液及1∶100体积比例的蛋白磷酸酶抑制剂混合物，95℃煮10 min，至蛋白膜溶解，后用BCA蛋白检测试剂盒，在多功能酶标仪上测定蛋白浓度。

按照细胞核-细胞质蛋白提取试剂盒说明操作抽提细胞核蛋白。50 mg组织，剪成小块，磷酸盐缓冲液冲洗，旋转弃去磷酸盐缓冲液。加入0.5～1 ml细胞质抽提缓冲液A（冰上）。4℃玻璃匀浆器中，匀浆组织20冲程，或直到在显微镜可见90﹪细胞破坏或裸核。4℃1000 g离心5 min，碎片包含裸核。为了除去细胞膜成分，做以下步骤：在100 μl的细胞质抽提缓冲液A液中，使核碎片再次悬浮，向其中加入5 μl细胞质抽提缓冲液B液，涡旋10 s，在冰上孵育1 min，1000 g离心5 min，收集核碎片，弃上清。100 μl细胞质抽提缓冲液A冲洗核碎片，1000 g转5 min，旋转，弃上清。向核碎片中加入70～100 μl核抽提缓冲液，涡旋（冰上），冰上孵育30 min，每5 min涡旋10 s。4℃离心12 000 g 5 min。上清液部分含有抽提的细胞核蛋白，将上清液转移至新管中，－70～－20℃保存。

1.6.3 蛋白电泳及检测 取出等质量的样品蛋白（30 μg）冰上裂解、匀浆、离心，取上清以考马斯亮蓝G250结合法测定样品蛋白含量，等量蛋白样品经12%的聚丙烯酰胺凝胶分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭4℃过夜，加抗TORC1和p-CREB一抗工作液（兔抗大鼠TORC1单克隆抗体，1∶1000；兔抗大鼠p-CREB单克隆抗体，1∶500）室温振摇2 h，加入荧光标记的二抗工作液（荧光标记羊抗兔二抗，1∶6000，Rockland）室温振摇1 h。以上各步骤间用磷酸盐缓冲液洗10 min×3次。暗室曝光-显影-定影，X线片用Cheni Imager 5500 V2103软件扫描，用Fluor Chen210软件进行定量分析得到积分吸光度（integrated absorbency，IA）。

1.7 统计学处理 采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。所得数据进行正态检验和方差齐性分析，符合正态分布者采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析和两组间的比较采用SNK-q检验。以P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 大鼠梗死体积百分比比较 本研究中有造模未成功的大鼠，已去除。造模成功后，干预组无大鼠死亡。对照组、小剂量TSA组和大剂量TSA组脑梗死体积比分别为（43.54±3.22）%、（40.26±2.30）%和（34.49±1.39）%；3组大鼠组间差异均有显著性（F=10.744，P=0.010）；大剂量TSA组梗死体积百分比低于对照组，差异有显著性（q=5.76，P=0.004）；小剂量TSA组梗死体积百分比与对照组相比，差异无显著性（q=2.09，P=0.148）。大剂量TSA组梗死体积百分比与小剂量TSA组相比，差异有显著性（q=3.68，P=0.027）（表1）。

2.2 大鼠TORC1和p-CREB的蛋白表达情况比较 4组大鼠细胞核TORC1蛋白（F=25.742，P＜0.001）、细胞TORC1蛋白（F=23.85，P＜0.001）和细胞核p-CREB蛋白表达（F=36.65，P＜0.001）情况如表2，组间差异均有显著性。

与对照组相比，假手术组的细胞核TORC1、细胞核p-CREB和细胞TORC1蛋白的表达差异均有显著性，q值分别为3.54、4.39及7.13，P值分别为0.047，0.027和＜0.001；与对照组相比，大剂量TSA组中细胞核TORC1、细胞核p-CREB和细胞TORC1的蛋白表达均增高，q值分别为10.12、8.55及9.33，P均＜0.001；与对照组相比，小剂量TSA组只有细胞核p-CREB和细胞TORC1的蛋白表达具有显著性，q值分别为6.31，6.75，P值分别为0.002和0.001；细胞核TORC1的蛋白表达无显著差异，q=2.87，P=0.083。

大剂量TSA组和小剂量TSA组细胞核TORC1的蛋白表达差异有显著性，q=6.12，P=0.003。大剂量TSA组和小剂量TSA组细胞TORC1的蛋白表达差异有显著性，q=5.33，P=0.010。大剂量TSA组和小剂量TSA组，细胞核p-CREB的蛋白表达的剂量高低无组间差异，q=1.39，P=0.838。

3 讨论

缺血性脑损害涉及一个复杂的病理生理过程，数分钟内即可发生细胞毒反应[11-12]，但同时也激活了内源性修复过程，从而抵抗神经组织过度损伤[13]。

CREB是位于神经细胞核内的转录因子，缺血性脑损害可通过激活细胞内的信号转导通路将信号由胞膜传到细胞核内，激活CREB，使其成为p-CREB。通过激活p-CREB/CRE通路介导的转录，可促进神经细胞的生长发育、分化、再生[5-6]。

表1 三组梗死体积百分比均数两两比较的q值及P值

表2 各组大鼠脑神经细胞核TORC1、p-CREB及脑神经细胞TORC1蛋白水平

TORC1作为一类强有力的CREB的共激活因子，未激活状态下处于磷酸化状态，位于细胞质中，唯有去磷酸化状态下的TORC1才可以穿过核膜进入细胞核，与p-CREB相结合后再与带有CRE序列的基因结合，促进下游基因的转录活性[4，6，14]，在神经组织修复过程中发挥重要作用[5-6，8-9，15-17]。Sasaki等[17]通过小鼠体外实验研究发现，脑缺血后，细胞核内TORC1-CREB通路被激活，导致p-CREB及其下游靶基因的活化，促进了皮质神经元的修复。本研究为大鼠体内实验，发现TSA在大鼠脑梗死急性期上调了缺血区顶叶皮质TORC1-CREB通路的蛋白表达，同时减小了梗死区的体积，具有脑保护作用。

TSA是丹参的关键成分之一，是从丹参的干燥的根和根茎中提取的，是菲醌派生物。近年来文献报道，TSA具有天然抗氧化、抗肿瘤、抗炎及保肝等多方面的药理作用[18-22]，它的神经保护作用与TORC1-CREB通路在脑缺血后的基因产物有关，如脑源性神经营养因子[6，8]（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、B细胞淋巴瘤/白血病2[23]（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等，BDNF是一种神经保护因子，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，均能够在脑缺血损伤时起到脑保护作用。

本实验结果显示，给予不同剂量的TSA对脑组织梗死的体积比和各因子蛋白表达的影响不同。与对照组相比，TSA干预后，细胞质中的TORC1激活后转位进入细胞核，导致TORC1核蛋白表达增多，TORC1-CREB通路激活，从而上调了早期保护性基因的表达，使脑组织梗死体积比下降，而且这种梗死体积比变化的程度与TSA的剂量有关。

本研究具有一定局限性。实验中各项指标的样本量较小，只观察了一个时间点，没有对TSA干预后大鼠长期神经预后进行观察，也没有对各细胞因子在干预后的时间变化进行分析，在以后的研究中我们会进一步探讨TSA在大鼠脑缺血模型中的时间和剂量效应。

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