卒中后抑郁细胞因子蛋白组学初探

耿磊钰，唐浩，李文平，钱方媛，钱俊峰，李凌江，张志

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是卒中后常见并发症之一。约有1/3卒中患者在卒中后不同阶段罹患PSD[1]。PSD严重阻碍卒中后神经功能恢复，增加病死率、致残率，降低患者生存质量，增加社会经济负担[2]。目前对PSD发病机制认识不一，有学者提出，细胞因子调节失衡是PSD的可能生物学病因[3]。已有研究显示，白细胞介素6（interleukin 1，IL-6）、白细胞介素18（interleukin 18，IL-18）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）等促炎因子水平在PSD患者中呈显著改变[4]。既往研究仅限于以上极少数细胞因子分析，缺乏系统性和全面性。本研究旨在利用蛋白组学方法系统观察卒中后急性期患者血浆中120种细胞因子水平与卒中后2周时PSD发生之间的关系，为PSD的细胞因子发病假说提供临床证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 研究对象均来自于2010年10月～2011年3月入住于我院神经内科的急性缺血性卒中患者，随访至卒中后2周，依据美国精神病学会《精神障碍诊断和统计手册》第4版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Ⅳ，DSM-Ⅳ）[5]标准诊断PSD，即患者必须同时表现心境低落，或兴趣或快感缺失以及至少4项其他抑郁症状，并持续2周以上。入组标准：①发病后3 d内入院的急性缺血性卒中患者；②年龄大于18岁；③卒中诊断符合1995年全国第4届脑血管病学术会议制定的《各类脑血管病诊断要点》[6]中有关脑梗死的诊断标准，并均经头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）证实；④随机选择符合PSD诊断及非PSD患者各12例纳入本实验进行细胞因子蛋白水平检测；⑤患者本人及家属签署书面知情同意书。

排除标准：①因意识、视力、听力、严重语言表达及理解障碍，无法完成检查者；②合并脑出血、蛛网膜下腔出血及短暂性脑缺血发作患者；③伴有帕金森病、癫痫、神经系统脱髓鞘疾病患者；④伴有严重躯体疾病者，包括心肝肾功能不全、休克、恶性肿瘤或血液病、自身免疫性疾病等；⑤既往有抑郁症病史及器质性精神疾病病史，近1年内有重大精神创伤史者；⑥近1个月内有药物、酒精及其他物质依赖或滥用者；⑦近1个月内发生感染或传染性疾病者。

住院期间，所有患者均行头颅MRI检查，以弥散加权像（diffusion-weighted imaging，DW I）序列所见明确急性梗死病灶为标准，测定梗死中心距额极直线距离。利用公式（a×b×c×0.5）/2[7]计算梗死灶体积（单位：cm3），其中a为梗死面积最大层面上病灶的最大横径，b为梗死面积最大层面上病灶的最大长径，c为梗死病灶累计层数，层厚为0.5 cm。影像学指标测量及计算由两名影像专业主治医师进行，取其平均值。

所有纳入本研究的卒中患者均接受了同等剂量抗血小板聚集药物治疗（阿司匹林100 mg/d）。本研究经东南大学医学伦理委员会审核批准。

1.2 临床资料收集及评估 本研究小组由经过培训的神经内科和精神科医生组成，所有的临床量表评估及PSD诊断均由2名高年资医师共同完成，如存有异议时会商确定。收集及评估以下临床资料：①一般资料：现病史、既往史、卒中危险因素包括高血压[8]、糖尿病[9]、卒中病史[6]、吸烟、饮酒史等。本研究中根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）关于吸烟情况调查方法的标准化建议将吸烟定义为：每天吸烟卷1支以上，连续或累计6个月[10]； 饮酒定义为：每周至少1次，连续6个月以上饮酒者；②神经功能评估：入院时及发病2周后两次进行神经功能评估，以美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评定神经功能缺损程度，Barthel指数评估功能残疾水平；③认知功能：卒中后2周，以简易精神状态检查量表（Mini-Mental State Examitation，MMSE）评定认知功能；④抑郁症状：卒中后2周，分别以汉密尔顿抑郁量表（the 17-item Hamilton Depression Rating Scale，HAMD）及汉密尔顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Scale，HAMA）评估患者抑郁症状及焦虑症状严重程度。

1.3 血浆细胞因子抗体芯片测定 患者入院后1 d清晨［卒中后（1.5±0.9）d］空腹留取静脉血4 ml，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）试管抗凝，3000 rpm离心20 min，留取并分装血浆样本，冻存于－80℃冰箱待检。利用人类细胞因子蛋白表达微阵列芯片（Human Cytokine Antibody Array G-Series 1000）进行血浆中共120种细胞因子蛋白水平检测，以质控血浆做重复检验，检测峰值及强度的变异系数均控制在误差范围内。并随机挑取10%细胞因子以酶联免疫吸附试验（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）进行验证检测，对实验室检测者及结果观测者均实行盲法（北京博奥生物有限公司）。

1.4 统计学处理 使用SPSS 17.0对数据进行统计分析，组间计数资料的比较采用χ2检验，计量资料采用单样本K-S正态性检验，对符合正态分布的资料，以均值±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；对不符合正态分布的资料，以中位数（四分位数范围）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。细胞因子抗体芯片信号强度经标准化后，点信号强度（spot signal intensity，SIs）表达差异＞1.5倍者，以Mann-Whitney U检验比较两组之间信号强度差别，QValue 1.0软件进行错误发现率（false discovery rate，FDR）多重校正。采用二元多因素Logistic向前逐步回归分析法评估细胞因子对卒中后急性期PSD发病的影响。正态性资料采用Pearson相关分析，非正态性资料采用Spearman非参数相关检验进行各因素间关联分析。以P＜0.05为差异具有显著性。

“老板”成为当前一些研究生对自己导师的称呼，这其实是对师生教育关系功利化的折射。“导师利用学生做科研，学生利用导师拿学位”正成为教育关系极端功利化的丑陋写照，导致师生关系严重异化。具体而言，教育关系的功利化主要有如下表现。

2 结果

2.1 PSD组与非PSD组一般临床资料比较 PSD组与非PSD组一般人口学资料、既往病史、病灶特征、神经功能比较均无显著性差异。两组患者卒中后两周HAMD评分（P＜0.001）及HAMA评分（P＜0.001）差异均有显著性（表1）。

2.2 PSD组与非PSD组血浆细胞因子蛋白水平比较 120种血浆细胞因子中，巨噬细胞炎症蛋白-3β（macrophage inflammatory protein-3 beta，MIP-3 beta）、胰岛素样生长因子1受体（insulinlike growth factor 1 receptor，IGF-I SR）、胎盘生长因子（placental growth factor，PIGF）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）4种细胞因子蛋白SIs在PSD组明显低于非PSD组，单因素分析中具有统计学差异，但均未能通过多重校正（表2）。

2.3 PSD相关细胞因子的多因素Logistic回归分析 将单因素分析有统计学意义的4种血浆细胞因子引入回归方程中，多因素Logistic回归分析结果未发现任何细胞因子蛋白SIs与卒中后两周PSD发生独立相关。

2.4 细胞因子蛋白SIs与抑郁、焦虑严重程度的相关性分析 PSD患者血浆IGF-I SR SIs与入院时Barthel指数评分呈显著负相关（r=－0.641，P=0.025）（图1），与卒中后两周HAMD（r=0.478，P=0.005）及HAMA评分（r=0.674，P=0.016）呈显著正相关（图2）。未发现其他因子与焦虑或抑郁严重程度有相关性。

3 讨论

本研究系统观察并分析了缺血性卒中患者急性期血浆120种细胞因子蛋白水平与卒中2周后PSD发生的关系。研究结果提示，在单因素分析中，PSD患者卒中后急性期血浆中4种细胞因子蛋白SIs显著低于非PSD患者，且血浆IGF-I SR SIs与入院时神经功能缺损程度及卒中2周后抑郁、焦虑严重程度均存在显著相关性。

表1 PSD组和非PSD组人口学资料及一般临床资料比较

表2 PSD组和非PSD组血浆差异表达细胞因子点信号强度比较

图1 卒中后抑郁患者血浆胰岛素样生长因子1受体蛋白（IGF-I SR）点信号强度与入院时Barthel指数评分呈负相关统计图

图2 卒中后抑郁患者血浆胰岛素样生长因子1受体蛋白（IGF-I SR）点信号强度与入院后2周汉密尔顿抑郁量表（HAMD）及汉密尔顿焦虑量表（HAMA）统计图。图A为IGF-I SR点信号强度与入院后2周HAMD呈正相关统计图；图B为IGF-I SR点信号强度与入院后2周HAMA呈正相关统计图

细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽的总称，根据细胞因子主要的功能可分为白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子-β家族、生长因子、趋化因子家族共7大类[11]。但目前对于PSD与细胞因子之间的研究多限于IL-6、IL-18、TNF-α等少数促炎因子[4]，缺乏各类细胞因子全面、同步、系统的研究结果。以细胞因子抗体芯片技术为依托的蛋白组学技术，具有快速、简易、高通量的优点，为筛选与疾病相关的潜在细胞因子生物学标志物提供了良好平台[12-13]。本研究严格筛选了符合入组标准的卒中急性期PSD患者作为研究对象；细胞因子蛋白芯片的自动操作，避免了人为的操作误差；质控血浆、检测变异系数的严格控制及随机样本的平行重复验证确保了检测准确性，以上均为本研究结果的可靠性提供了良好保障。

本研究发现4种细胞因子蛋白SIs在PSD组明显低于非PSD组。值得关注的是，除MIP-3 beta参与炎症反应外，另外3种均归属于生长因子亚族，分别为PIGF、VEGF及IGF-I SR。已有研究证实，VEGF与PIGF具有高度同源碱基序列，PIGF作为一种分泌型同型二聚体糖蛋白，因最初在人类胎盘中发现而命名，被认为是VEGF家族中的一员，二者功能具有相似性[14]。

此外，本研究还发现IGF-I SR蛋白血浆SIs在PSD组显著低于非PSD组，且PSD患者血浆IGF-I SR蛋白信号强度越高，入院时神经功能缺损程度及2周后抑郁、焦虑症状越重。IGF-I是由70个氨基酸残基组成的多肽，主要在肝脏合成，IGF-I可以穿过血脑屏障与其受体相结合。其受体IGF-I SR主要分布在大脑皮质的表层和深层，嗅球，丘脑核和海马等处，神经元突触结构亦表达IGF-I SR，具有促进细胞增殖、分化等多种生物活性[21-22]。此前IGF-I SR与精神分裂症的关系已引起学者的关注[23]，李则挚等[24]和易正辉等[25]利用全基因组外周血基因表达谱芯片分析显示IGF-I SR基因在亚综合征抑郁（subsyndromal symptomatic depression，SSD）中表达下降，且SSD患者外周血IGF-I SR基因mRNA表达水平比正常对照组降低17.63%，有统计学差异。以上发现与本研究结果相一致，进一步证实IGF-I SR与抑郁发病相关。此外，更有学者指出，IGF-I与脑源性神经营养因子协同使用具有更显著的促进海马再生及抗抑郁效果，甚至有研究发现，脑源性神经营养因子抗抑郁疗效具有IGF-I依赖性[26]。

本研究存在一定局限性。首先，样本量偏小，导致统计效力不足；其次，随访期仅至卒中后2周，对PSD的诊断存在一定时间局限性；第三，卒中急性期细胞因子干扰因素复杂，可能造成检测结果偏倚。

综上所述，本研究初步探讨了缺血性卒中后急性期血浆细胞因子水平与卒中后2周时PSD发生的关系。结果提示，PSD患者卒中后急性期血浆中4种细胞因子蛋白表达水平异常，但未能通过多重校正。因此，卒中急性期血浆细胞因子水平尚不能作为预测PSD发生的独立危险因素，但3种生长因子水平的异常提示PSD可能存在突触可塑及神经再生障碍。本研究结论尚需在大样本研究中进一步验证。

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