心房肌基质金属蛋白酶及其抑制剂、凋亡相关基因表达改变与增龄性心房颤动关系的研究*

董丽君，汤宝鹏，周贤惠，李晋新，张宇，孙凌，李耀东，张疆华，邢强，许国军

心房肌基质金属蛋白酶及其抑制剂、凋亡相关基因表达改变与增龄性心房颤动关系的研究*

董丽君，汤宝鹏，周贤惠，李晋新，张宇，孙凌，李耀东，张疆华，邢强，许国军

目的：本研究目的是为论证在增龄性心房颤动（房颤） 时基质金属蛋白酶-9链（MMP-9）与基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）、抗凋亡基因（BCL-2）与促凋亡基因（BAX）的表达改变是否与心房结构重构有关，以期为增龄性房颤的发病机制及药物干预提供可能的策略与思路。

心房颤动；增龄；心房结构重构；心房纤维化；细胞凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1034.)

心房重构被认为是心房颤动（房颤）持续的根本原因，包括电重构、结构重构和收缩重构[1]。结构重构可能是心肌细胞去分化的适应过程，是心房肌本身的自我防御，也可被理解为一种不良适应过程，即心肌细胞被纤维组织替代的退化进程[2]。房颤时从细胞、离子通道、以及分子水平均发生明显的改变。而基质金属蛋白酶（MMPs）和其内源性抑制剂[金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）]的表达调控近年来被认为与心房纤维化重构关系密切[3]。尽管其过程各具不同特征，所有的适应过程最终表现为细胞存活，部分发生结构重构的心肌细胞可能激活程序性细胞死亡过程[4]。而且，这个动态过程受抗凋亡基因（BCL-2）与促凋亡基因（BAX） 表达的调控[5]。

本研究通过慢性房颤犬模型，为进一步阐明伴随着心房老化或者在房颤这种疾病状态下，MMP-9与 TIMP-1，BCL-2与BAX的表达改变是否与心房结构重构有关，包括组织形态及细胞超微结构的改变、加速的纤维化和细胞凋亡，以期为增龄性房颤的发病机制及药物干预提供可能的策略与思路。

1 材料与方法

实验动物：本实验于2013-04至2014-04进行。选杂种犬28只，雌雄兼有，体重18～26（19.64±5.87）kg，常规行12导心电图、心脏彩超并结合兽医体检评价为健康犬。根据不同年龄分为成年犬14只，平均年龄（2.2±0.3）岁, 其中成年窦性心律犬和成年慢性房颤犬各7只；老年犬14只，平均年龄（8.8±1.75）岁，其中老年窦性心律犬和老年慢性房颤犬各7只。该实验方案经新疆医科大学动物实验中心伦理委员会审核批准并结合美国国立卫生研究所1996年制定的有关动物实验伦理原则为指导实施。

犬慢性房颤模型的建立：实验犬术前12小时禁食水，常规消毒铺巾。盐酸氯胺酮（100 ml/2 ml） 1支、地西泮（10 mg/2 ml）1支、阿托品（0.5 mg/ ml）1支，混合后稀释1倍，剂量：15 mg/kg，肌内注射基础麻醉后，建立静脉通道，枸橼酸芬太尼注射液0.1 mg静推。氯化琥珀胆碱注射液（司考林）300 mg与枸橼酸芬太尼注射液0.1 mg溶于250 mL 0.9%氯化钠注射液中静脉滴注维持肌肉松弛。待犬的状况稳定后行气管插管，呼吸机辅助呼吸，调节氧流量4～6 L/min，潮气量为20 mL/kg，呼吸压力0～2 kPa。分别在双后肢和前肢刺入5号针头，按照标准连接心电图导线，动态记录犬正常II导联心电图。取右侧卧位，左侧胸部剪除犬毛，用碘酒、酒精消毒手术区，左4～5肋间隙为切口，逐层切开皮肤、皮下肌层，开胸器放于切口中，逐层开胸打开心包，暴露左心耳，采用荷包缝合将起搏电极缝合固定于左心耳底部。用起搏分析仪测量各项电参数（电压阈值＜1 mV，阻抗500～1000 Ω），然后将电极尾端与实验用动物埋藏式高频心脏起搏器相连，用lead-2000多导电生理记录仪，描记标准体表心电图，磁铁靠近后开启起搏器，起搏频率600次/分，观察起搏器工作状态，若起搏状态良好，快速起搏后出现房颤，关闭起搏器，检查心包、胸腔无出血后将起搏器埋藏于胸部皮下囊袋内。术毕关闭胸腔，逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤，无菌纱布包扎切口。术后使用头孢唑啉钠针1.5 g，2次/日，连续静点3天预防感染，盐酸吗啡注射液20 mg皮下注射止痛，营养支持1周，观察犬的生命体征。待一般情况稳定后开启起搏器予以连续起搏4周左右，动态监测心电图证实为持续性房颤。

实时荧光定量聚合酶链反应实验（ RealtimePCR）：①取100 mg左心耳组织，用Trizol（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA，美国）一步法提取总RNA。取2 μg总RNA参照逆转录试剂盒（Bio-Rad, Hercules, CA，美国）进行操作逆转录成cDNA。②引物序列：（TaKaRa Biotechnology, 中国大连）。③Real-timePCR体系（25 μl）：待测样品cDNA稀释5倍，然后取cDNA 2 μl，SybrGreen qPCR Master Mix 12.5 μl（Applied Biosystems,Carlsbad, CA，美国），上游引物（10 μM）0.5 μl，下游引物（10 μM）0.5 μl，ddH2O 9.5 μl。④反应条件：95℃预变性2 min，随后进入PCR 循环，95℃变性10 s，56℃褪火30 s，72℃延伸40 s，40个循环。反应完成后根据Ct值计算2-△Ct得出目的基因的 mRNA相对表达量。⑤电泳：取目标基因及内参照基因β肌动蛋白（β-actin）PCR产物5 μl，用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳，在BIO-RAD凝胶成像系统上扫描获得目标基因产物的电泳图像。

蛋白质免疫印迹法（Western blot）：组织总蛋白提取按试剂盒（北京索莱宝）说明操作，总蛋白含量按 BCA法测定[6]。聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离总蛋白，每孔上样量为50 μg，然后将胶上的蛋白通过电转印迹到硝酸纤维素 （NC）膜上。5%脱脂奶粉/TBS液封闭、洗脱后加入1抗体或β-actin抗体（工作浓度1：2000）进行杂交，4℃孵育过夜，经辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔-IgG（工作浓度1：2000）Ⅱ抗孵育1 h，进行二氨基联苯胺（DAB）显色，所有杂交信号在BIO-RAD凝胶成像系统进行扫描定量。

心肌光镜和超微结构检测：取自左心房的组织被立即固定在4℃的4%低聚甲醛溶液中并包埋石蜡中。利用光学显微镜分别对被苏木精和伊红染色以及马森三色染色（Masson）的半薄切片（2 μm）进行观察。每个取材点至少两个切片，每个切片至少200个有核细胞被分析以量化心肌细胞肌溶解和纤维化的程度，其范围以数字图像自动测量，利用电子显微镜观察被醋酸盐和柠檬酸铅染色的各个样本的超薄切片（50～100 nm）。

应用TUNEL法检测心房肌细胞凋亡：应用电镜观察窦性与房颤犬心房肌细胞超微结构，计算其凋亡指数（AI），观察分析增龄性房颤动态演变中伴随的细胞凋亡与结构重构。

统计学处理：研究数据均以Excel数据库录入，数据的统计分析采用SPSS13.1统计软件包进行，计量资料用均数±标准差描述，首先对数据进行正态性检验和方差齐性检验后两组间比较采用方差检验，变量间相互关系采用直线相关分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1纤维化改变：图1所示，所有的成年犬与老年犬比较，在老年犬左心房心肌组织肌细胞之间的纤维组织显得更加致密且紧凑，肌束被大量的结缔组织分隔开，以胶原的过度积聚为特征，结缔组织[成年犬（4.1±0.9）% vs老年犬（ 8.4±1.0）%，P＜0.05]更多的沉积被显现。此外，在相同年龄的窦性心律犬和慢性房颤犬之间的比较中显示，慢性房颤犬的心肌纤维化均更加明显[成年窦性心律犬和成年慢性房颤犬之间（4.1±0.9）% vs （14.7±2.1）%，P＜0.01；老年窦性心律犬和老年慢性房颤犬之间（8.4±1.0%） vs （18.2±2.4）%，P＜0.01）]，在肌束之间的纤维组织排列更加紊乱无序。

图1 左心房心肌组织纤维化表现光镜图

2.2细胞超微结构的改变：图2所示，图2A示成年窦性心律犬左心房肌细胞肌原纤维节排列有序，线粒体大小均一，在核膜内染色质结构正常；图2B示老年窦性心律犬肌细胞超微结构异常，肌原纤维节出现了一定程度的退化，一些线粒体嵴膨胀且密度减小，伴着染色质及核膜变形的核固缩，胀大的内质网，增多的糖原，更加致密且紧凑的肌纤维；图2C示成年慢性房颤犬肌细胞超微结构更加异常，肌原纤维节出现了严重的退化，线粒体膨胀明显，核固缩伴随着部分细胞凋亡，可见一些次级溶酶体，肿大的内质网，较少的糖原，紊乱而无序的肌纤维；图2D示老年慢性房颤犬肌细胞超微结构明显异常，肌原纤维节出现了更加严重的退化，线粒体空泡变性，严重的核固缩伴随着更多的细胞凋亡，更多的次级溶酶体，明显肿大的内质网和一些肌丝的崩解。

图2 左心房心肌组织细胞超微结构改变电镜图

2.3细胞凋亡：老年犬较成年犬的左心房肌细胞肌溶解比例增高，细胞凋亡的TUNEL阳性率明显地增高[（32.9±3.4）% vs （22.0±5.5） %，P＜0.05）]，多数细胞核带着弱的TUNEL染色且其中异染色质体积增大而均匀分布（图3A、3B ）。慢性房颤犬较窦性心律犬细胞凋亡的阳性率均显著地增高[成年慢性房颤犬和成年窦性心律犬之间（33.4±3.9）% vs（22.0±5.5）%，P＜0.01；老年慢性房颤犬和老年窦性心律犬之间（51.2±3.4）% vs（32.9±3.4）%，P＜0.001]，老年慢性房颤犬增高最为明显，而且一些已固缩的细胞核带着强的TUNEL染色（图3C、3D）。

2.4左心房肌MMP-9/ TIMP-1和BCL-2/BAX在mRNA 和蛋白质表达水平的改变：老年窦性心律犬与成年窦性心律犬比MMP-9和BAX在mRNA和蛋白质表达水平均显著地增高（P＜0.05）；而TIMP-1和BCL-2在mRNA和蛋白质表达水平均显著地下降（P＜0.05），差异有统计学意义。在相同年龄的窦性心律犬和慢性房颤犬之间的比较中显示，成年和老年慢性房颤犬的MMP-9和BAX在mRNA 和蛋白质表达水平均显现出有意义的上调趋势（P＜0.05），尤其是老年房颤犬这种上调趋势最为明显（P＜0.05）；相反，成年和老年慢性房颤犬的TIMP-1和BCL-2在mRNA 和蛋白质表达水平均显现出有意义的下调趋势（P＜0.05），尤其是老年房颤犬这种下调趋势最为明显（P＜0.05），差异均有统计学意义。表1、表2

表1 成年犬和老年犬窦性心律与慢性房颤时左心房心肌组织MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在mRNA表达水平比较（n=7，

表1 成年犬和老年犬窦性心律与慢性房颤时左心房心肌组织MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在mRNA表达水平比较（n=7，

注：与窦性心律成年犬比较aP＜0.05；与同年龄窦性心律比较bP＜0.05。MMP-9 ：基质金属蛋白酶-9 TIMP-1：基质金属蛋白酶抑制剂-1 BCL-2：抗凋亡基因 BAX：促凋亡基因

MMP-9 TIMP-1 BAX BCL-2成年窦性心律犬 1.1483±0.2371 3.1602±0.3029 1.2520±0.2831 2.9571±0.3745老年窦性心律犬 1.8520±0.3029a 2.1139±0.2273a 1.9520±0.1824a 1.8623±0.3382a成年慢性房颤犬 2.1372±0.2981b 1.9126±0.3812b 2.7361±0.2937b 1.5620±0.2490b老年慢性房颤犬 2.8072±0.3369b 1.1683±0.1927b 3.2532±0.3271b 0.8524±0.2176b

表2 在窦性心律与慢性房颤时成年犬和老年犬左心房心肌组织MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在蛋白质表达水平比较（n=7，

表2 在窦性心律与慢性房颤时成年犬和老年犬左心房心肌组织MMP-9、TIMP-1和BCL-2、BAX在蛋白质表达水平比较（n=7，

注：与窦性心律成年犬比较aP＜0.05；与同年龄窦性心律比较bP＜0.05。余注见表1

MMP-9 TIMP-1 BAX BCL-2成年窦性心律犬 0.1738±0.0329 0.7620±0.0572 0.2165±0.0263 0.6850±0.0562老年窦性心律犬 0.3093±0.0462a 0.5833±0.0429a 0.4281±0.0390a 0.5192±0.0509a成年慢性房颤犬 0.4473±0.0528b 0.3982±0.0320b 0.5018±0.0472b 0.3278±0.0297b老年慢性房颤犬 0.6172±0.0627b 0.2207±0.0313b 0.7163±0.0572b 0.1629±0.0162b

图3 比较各组左心房心肌组织细胞凋亡的TUNEL染色变化

3 讨论

心肌纤维化是一个动态的过程，其中正常的胶原链被降解，取而代之的是纤维性的间质沉着物，金属蛋白酶与基质的降解和胶原的合成关系密切。房颤时由于细胞因子介导的MMPs/TIMPs系统间相互作用的失衡，使细胞外基质重构，这可能是房颤是心房结构重构的机制之一[7]。伴随着心房老化或者在房颤这种疾病状态下，金属蛋白酶在保持细胞外基质的平衡中起到至关重要的作用，这些蛋白水解酶在转录和翻译水平受内源性生理抑制剂如TIMPs的调控。在大多数疾病过程中，MMPs和TIMPs相互作用的动态过程将决定表型变化，促纤维化信号的强弱将决定二者的平衡。此外，促纤维化信号可以刺激成纤维细胞增生和纤维连接蛋白、胶原I和III、葡聚糖蛋白及其它细胞外基质成分的沉积[8-10]。本研究发现在老年犬中受损的基质降解的证据，与成年犬比较，MMP-9在mRNA和蛋白质水平表达增高而TIMP-1表达下调。而TIMP-1表达下调被认为与左心房、左心室扩大密切相关。因此，TIMP-1表达异常将可能导致左房扩大、心肌细胞肥大和收缩功能丧失。依次地，被改变的MMP-9/ TIMP-1化学计量学效能可能导致对MMP-9生物效能的失控，MMP-9高表达将导致心房纤维化加重。在组织坏死因子、血管紧张素及细胞因子等共同参与下[11,12]，MMPs和TIMPs比例更加失衡从而导致心房结构重构。

本研究发现，老年犬左心房组织结构的最大变化是分布在肌细胞之间的纤维组织过度增生，尤其在老年房颤犬心房组织中这种纤维化程度更加明显，既往诸多的研究证实[13,14]，间质纤维化可以减低心肌细胞间的电耦联，从而阻碍了心肌细胞及肌束之间的电传导。其直接的后果是心房肌由标准的均一性传导而转向不均一的各向异性传导，这种纤维化优先地影响细胞间横向联结而非纵向传导，这将引起更加缓慢而曲折的传导播散。由此我们推测，发生在老年心房肌的期前刺激在传导过程中更易出现单向阻滞和传导延缓从而易导致折返，这种由纤维化导致心房电和结构重构易成为老年心房潜在的致房性心律失常的机制。

本研究发现，伴随着心房老化或者在房颤这种疾病状态下，老年窦性心律犬与老年房颤犬心房肌含有更多的凋亡细胞。与成年窦性心律犬的比较中，老年窦性心律犬BAX高表达而BCL-2低表达，同样地，这种异常的表达在成年与老年房颤犬中亦显现出来。由此我们认为，尽管促细胞凋亡和与之相反的保护机制共存，但是，伴随着心房老化或房颤这种疾病状态下，在左心房心肌组织中具有保护机制的蛋白表达呈现下降趋势而促凋亡的蛋白表达呈现上升趋势，这种状态的持续最终导致左心房肌细胞凋亡的发生。

以往的研究结果显示，BCL-2可以诱导心肌细胞处于“代谢冬眠状态”，这将能提高心肌细胞对于应急伤害的耐受力。由于细胞凋亡需要能量，伴随严重的ATP耗竭随之而来的是坏死而非细胞凋亡[15]。正如前所述，心肌细胞凋亡是“温和的”而反复性的长期过程，伴随着心房老化或者在房颤这种疾病状态下所出现的，如局部缺血、紧张、负荷过重等长期的应急状态，这将渐进地抑制了保护机制（如BCL-2低表达）而激活了促凋亡径路（如BAX高表达）。尤其对于衰老的心房，额外的较小伤害性刺激如高频心率便足以以随机的方式促发本已脆弱的心肌细胞凋亡。如何定义程序性细胞存活和死亡分界点仍然是大的挑战。所以我们认为，这种伴随增龄与房颤而显现的MMP-9与 TIMP-1，BCL-2与BAX改变可能是增龄性房颤心房重构的分子机制之一。

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Relationship Between Atrial MMP-9/TIMP-1 With Apoptosis Related Gene and Aging With Atrial Fibrillation in Experimental Dog Model

DONG Li-jun, TANG Bao-peng, ZHOU Xian-hui, LI Jin-xin, ZHANG Yu, SUN Ling, LI Yao-dong, ZHANG Jiang-hua, XING Qiang, XU Guo-jun.
Department of Cardiology, First Aff i liated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi (830011), Xinjiang, China

TANG Bao-peng, Email: tangbaopeng@126.com

Objective: To explore the relationship between atrial MMP-9 with its inhibitor (TIMP-1), anti-apoptosis gene (BCL-2) with apoptosis gene (BAX) and the aging with atrial remodeling in experimental dog model during atrial fi brillation (AF), in order to better deal with the aging caused AF.Methods: The experimental dogs were divided into 4 groups: ①Adult with sinus rhythm (ASR) group, ②Elder with sinus rhythm (ESR) group and ③Adult with AF (AAF) group, ④Elder with AF (EAF) group. n=7 in each group. Chronic AF model was induced by rapid and persistent atrial pacing. The mRNA and protein expressions of MMP-9, TIMP-1 and BCL-2, BAX were measured by real time quantitative RT-PCR and Western blot analysis. The cellular ultra structural remodeling was examined by optical/electron microscopy, and the apoptosis index was determined by TUNEL method,Results: Compared with adult dogs, the elder dogs showed obviously increased expressions of MMP-9, BAX, and decreased expressions of TIMP-1, BCL-2, all P＜0.05. Compared with SR gods, the AF dogs presented up-regulated expressionsof MMP-9, BAX, all P＜0.05, and down-regulated expressions of TIMP-1, BCL-2, all P＜0.05, such changes were most obvious in elder AF dogs. Accompanying with the aging and AF, the degree of atrial fi brosis, cellular ultra structure and the apoptosis index were changed with the statistic meaning.Conclusion: The abnormal expressions of MMP-9/TIMP-1 and BCL-2/BAX might be one of the molecular mechanisms for aging caused AF in experimental dog model.

Atrial fi brillation; Aging; Atrial remodeling; Atrial fi brosis; Apoptosis

2014-05-12）

（编辑：常文静）

新疆维吾尔自治区自然科学基金（2011211A074）

830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市， 新疆医科大学第一附属医院 心脏中心

董丽君 住院医师 硕士研究生 主要研究方向为心律失常的电生理机制 Email: junjun19870817@163.com 通讯作者：许国军

Email: xuguojun2001@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1034-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.018

方法：通过持续快速心房起搏建立慢性房颤犬模型，用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测4组犬（成年窦性心律犬，老年窦性心律犬，成年慢性房颤犬，老年慢性房颤犬各7只）MMP-9与 TIMP-1、BCL-2与BAX在mRNA和蛋白质表达水平变化。应用光镜、电镜及TUNEL法分别检测细胞结构重构和细胞凋亡。

结果：与成年窦性心律犬比较，老年犬MMP-9和BAX在mRNA和蛋白质的表达均显著地增高（P＜0.05），而TIMP-1和BCL-2的表达均显著地下降（P＜0.05）；与窦性心律犬比较，房颤犬MMP-9和BAX表达水平均显现出有意义的上调趋势（P＜0.05），尤其是老年房颤犬最为明显；TIMP-1和BCL-2表达水平均显现出有意义的下调趋势（P＜0.05），尤其是老年房颤犬最为明显。伴随老龄与房颤，犬心肌纤维化程度、细胞超微结构及凋亡指数均显现出有统计学意义的改变。

结论：伴随增龄与房颤而显现的MMP-9与 TIMP-1，BCL-2与BAX改变可能是增龄性房颤心房重构的分子机制之一。