Ghrelin对大鼠心室肌细胞L型钙电流的影响

杨波，张道亮， 胡有志 ，肖金凤， 周承志

Ghrelin对大鼠心室肌细胞L型钙电流的影响

杨波，张道亮， 胡有志 ，肖金凤， 周承志

目的： 研究一种具有生长激素释放活性的脑肠肽（Ghrelin）对大鼠心室肌细胞L型钙电流的影响。

Ghrelin；L-型钙电流；全细胞膜片钳技术

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:832.)

Ghrelin是一种具生长激素释放活性的脑肠肽。以往的研究多集中在Ghrelin调节生长激素分泌及能量代谢、促肥胖等作用。近年来，随着其生物学作用领域的拓展，Ghrelin在心血管系统中的作用不断的显露出来，其能增强心肌收缩力，改善心肌的能量代谢，有效抑制内皮细胞的凋亡及炎症反应，促进血管新生[1，2]。另外，Ghrelin还能舒张血管、延缓心力衰竭的发展及抗心律失常的作用。这些研究结果表明Ghrelin具有强大的心血管保护作用。研究发现Ghrelin可抑制胃肠道平滑肌细胞膜钙敏感性钾电流，而L型钙电流（L-type calcium channel，ICa-L）与心脏电生理有着至关重要作用，目前Ghrelin对心室肌细胞L型钙通道的作用尚少见报道，本研究通过酶解获得单个心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术，研究Ghrelin对大鼠心室肌细胞ICa-L的影响。

1 材料与方法

单个心室肌细胞的分离：取SD大鼠（雄性、体重200～250 g、由华中科技大学同济医学院动物中心提供）腹腔注射肝素200 IU/kg，颈椎脱臼法处死。迅速开胸去取出心脏，修剪并游离出主动脉，插入主动脉套管置于离体灌流系统，分别给与无钙台式液、酶液灌流。当心脏胀大蓬松并呈透明色时，剪下心室置于细胞保存液中，剪碎、吹打、静止3分钟后，取上清液即为含有单个心肌细胞的细胞悬液，用同样的方法获得第二杯、第三杯。均在室温下保存约1 h后备用。

全细胞膜片钳技术 ：将细胞悬液滴入灌流槽中，静止后，分别给与含有不同浓度Ghrelin的细胞外液进行灌流。选取横纹清楚、边缘锐利、不收缩的单个心室肌细胞作为实验对象。玻璃毛坯（中科院上海神经研究所）经微电极拉制仪拉制成尖端为1～1.5 μm 的电极，灌注电极内液后入水阻抗为3～5 MΩ最佳。电极入水，补偿液接电位后调节三维操纵器使电极尖端移至细胞表面，稍加负压进行封接。当阻抗达到1 GΩ 以上，补偿快电容后破膜形成全细胞记录模式，进行慢电容、串联电阻补偿后记录ICa-L、稳态激活曲线、稳态失活曲线及失活后恢复曲线。

溶液与试剂 ：Tyrode液（mmol/L）：NaCl 135、KCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、Glucose 10、NaOH调PH至7.35；无钙Tyrode 液为Tyrode 液中不加CaCl2。细胞保存液为含0.8 mmol/L CaCl2无钙Tyrode液。记录ICa-L的电极内液成分（mmol/L）： CsCl 120、CaCl21.0、MgCl25、Na2ATP 5.0；EGTA 11、HEPES 10、Glucose 11；用NaOH 调PH至7.35。记录ICa-L的细胞外液成分为Tyrode 液。Ⅰ型胶原酶、EGTA、CsCL、Na2ATP、HEPES、Ghrelin、小牛血清均为Sigma公司试剂，其余为国产分析纯。

ICa-L的记录 ：保持电位-40 mV，给予+20 mV，钳制时间350 ms的刺激引出+20 mv下ICa-L。反复记录ICa-L，待ICa-L幅值稳定后，记录不同浓度下的Ghrelin对ICa-L、稳态激活曲线、稳态失活曲线、失活后恢复曲线的影响。在记录的电流期间，注意避开ICa-L的增强与衰减（“runup”与“rundown”）现象。钳制电位-40 mV可失活钠电流及T型钙电流（ICa-T），电极内液中CsCl可阻断钾通道。

ICa-L电流刺激程序：钳制电位-40 mV，给予-40 mV至+60 mV、350 ms、阶跃为10 mV的指令电压。ICa-L稳态失活曲线刺激程序：保持电位-40 mV，给予-60 mV至+30 mV、1 ms，阶跃10 mV的系列脉冲，在每一个条件脉冲后紧跟着一固定的去极化至20 mV，300 ms的脉冲，然后回到-40 mV。ICa-L失活后恢复曲线刺激程序：采用双脉冲刺激，保持电位-40 mV，给予+20 mV、300 ms的刺激，然后回到-40 mV持续50 ms，再给予+20 mV、300 ms的刺激，前后两个脉冲的间隔时间逐渐增加，每次增加50 ms，共12次脉冲。

2 结果

不同浓度的Ghrelin对ICa-L的影响：ICa-L在-30 mV左右激活，20 mV达峰值，10 nmol/L、100 nmol/ L及1 μmol/L Ghrelin对峰电位的抑制率分别为8.95 % ± 2.13%、31.18%±4.78%及 64.63% ±8.57%（n=6，P＜0.05）。图1

图1 Gherlin对L型钙电流的影响

Ghrelin对ICa-LI-V曲线的影响：电流密度为电流值与细胞膜电容的比值（pA/pF）。以电流密度为纵坐标，所对应的的测试电压为横坐标作出I-V曲线，图2。结果显示不同浓度的Ghrelin均使各测试电压下的ICa-L减小，I-V曲线上移。

图2 Gherlin对L型钙电流I-V曲线的影响

Ghrelin对ICa-L稳态激活曲线的影响：将电流值按Boltzmann方程进行拟合：G/Gmax=I/ [1+exp(VT- VI/2/k)]（k为斜率因子，VI/2为通道的半激活电压，G为电导）。G=ICa-L/(V-Vrev)，（Vrev为翻转电位）。各组半数激活电压差异无统计学意义，对稳态激活曲线影响差异无统计学意义（n=6，P＞0.05）。图3

图3 Gherlin对L型钙电流稳态激活曲线的影响

Ghrelin对ICa-L稳态失活曲线的影响：将电流值 经Boltzmann方 程I/Imax=I/[1+exp(VT-VI/2/k)]进行拟合。10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L Ghrelin使VI/2从（-1.34±1.9） mV分别降至（-8.04±1.32 ）mV，（9.76±1.17 ）mV及（-11.81±0.73）mV (n=6，P＜0.05)。图4

图4 Ghrelin对L型钙电流稳态失活曲线的影响

Ghrelin对ICa-L失活后恢复曲线的影响：将电流值进行单指数方程拟合：I(%)=A＋Bexp(-t/τ)，求出恢复曲线的时间常数(τ)值并进行统计分析。10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L Ghrelin使 失 活后恢复曲线下移，延长通道失活恢复时间，由给药前τ值63.23±9.32，分别增至98.95±10.74、109.56±13.42和127.39±16.13，差异有统计学意义（n=6，P＜0.05）。图5

图5 Ghrelin对L型钙电流失活后恢复曲线的影响

3 讨论

Ghrelin是一种28个氨基酸的多肽，为生长激素促分泌素受体天然配体，能够促进生长激素的释放。Ghrelin受体不仅存在下丘脑，在血管、心脏中，在心血管系统中具有多种生物学效应。①Ghrelin具心脏保护作用。有研究报道Ghrelin水平与右心室收缩末容积负相关，与右心室射血分数正相关，提示其有正性肌力的作用[3]。其还可改善大鼠心肌结构和功能，延缓心源性恶液质的发展。另外，有研究报道Ghrelin能抑制心肌梗死后心室重构，对心肌缺血在灌注损伤心脏具有保护作用，抑制心肌细胞及内皮细胞的凋亡[4]。②Ghrelin能够收缩冠状动脉、扩张大动脉、抑制血管钙化。③Ghrelin降低小鼠动脉压，研究者认为其可能机制是抑制了交感神经活性[5]。最近有研究报道，Grelin能改善大鼠心肌梗死后心脏的电生理学特性，上调心肌Cx43的表达，防止室性心律失常的发生[6]。然而Ghrelin对于单个心肌细胞电生理特性少见报道，本研究旨在探讨Ghrelin对大鼠心室肌细胞膜上ICa-L的影响，为阐明Ghrelin心脏保护作用提供理论基础。实验通过全细胞膜片钳技术对，观察Ghrelin对细胞膜上的L-钙通道的动力学影响。

研究结果显示Ghrelin可抑制ICa-L峰值，使I-V曲线上移，稳态失活曲线左移，失活后恢复曲线右移，提示Ghrelin通过加快钙通道的失活，及延长通道失活后恢复的时间，来抑制心室肌细胞Ca2+的内流。ICa-L与心脏的多种生理功能密切相关，在心肌细胞动作电位中起着重要作用，是维持较长平台期的主要内向电流。此外它也是肌浆网释放Ca2+的主要触发机制，即以Ca2+释放Ca2+，从而促进兴奋-收缩偶联。在心肌缺血等异常状态下，大量Ca2+进入细胞内，触发肌浆网钙释放，造成钙超载，钙超载一方面可启动细胞坏死及凋亡程序导致心肌细胞的不可逆死亡[7,8]，另一方面还可导致恶性室性心律失常的发生并增加心血管病患者猝死发生率[9]。因此，有研究者认为抑制L-Ca2+通道活性可在钙运作的起始阶段达到抑制细胞内钙超载的发生，从而产生心脏保护作用[10]。在本研究中，Ghrelin对ICa-L的具有剂量依赖性地抑制作用，这一结果为Ghrelin对心血管系统的保护机制提供了一种可能的原因，即Ghrelin通过抑制ICa-L从而降低心肌细胞内钙浓度，最终达到抑制细胞内钙超载引起的心肌损伤作用。由于本研究未在疾病模型上验证Ghrelin对ICa-L的作用，因此今后仍需在疾病模型上进一步验证Ghrelin对心肌细胞钙运作的影响。

以往有研究报道，Ghrelin 可以剂量依赖的方式降低低频刺激下单个心肌细胞的张力和收缩、舒张速率，提示其对心肌细胞具有负性肌力作用[11]。而与此不一致的是，一项研究中健康人和心衰患者静脉注射Ghrelin 后，在心率没有明显改变的情况下，扩张动脉血管，显著降低后负荷，有效地增加心搏出量、心脏指数、心输出量，提示Ghrelin 对在体心脏功能的作用可能受到多种因素的影响。故Ghrelin对于整体心脏的作用，仍待进一步研究。

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Effect of Ghrelin on L-type Calcium Channel Current of Ventricular Myocytes in Experimental Rats

YANG BO, ZHANG Dao-liang, HU You-zhi, XIAO Jin-feng, ZHOU Cheng-zhi.
Department of Cardiology, Aff i liated Hospital of Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan (430061), Hubei, China

ZHOU Cheng-zhi, Email: acheng8341@163.com

Objective: To study the effect of ghrelin on L-type calcium channel current (ICa-L) of ventricular myocytes in experimental rats.Methods: The single ventricular myocyte in experimental rats were obtained by enzymolysis method, and the whole-cell patch-clamp technique was used to investigate the effect of ghrelin on ICa-L of ventricular myocytes at different doses of 10 nmol/L, 100 nmol/L and 1μmol/L respectively.Results: Ghrelin at 10 nmol/L, 100 nmol/L and 1μmol/L may inhibit ICa-L at (8.95 ± 2.13) %, (31.18 ± 4.78) % and (64.63 ± 8.57)% respectively, P＜0.05, and the current-voltage curve was shifted upwards. The channel half inactivation curve decreased from (-1.34 ± 1.9) mV to (-8.04 ± 1.32 ) mV, (9.76 ± 1.17) mV and (-11.81 ± 0.73) mV respectively, P＜0.05, and the recovery time after inactivation was prolonged as τ value from (63.23 ± 9.32) to (98.95 ± 10.74), (109.56 ± 13.42) and (127.39 ± 16.13) respectively, P＜0.05.Conclusion: Ghrelin may accelerate ICa-L inactivation and prolong the recovery time after inactivation. Ghrelin inhibits ICa-L in a dose-dependent manner.

Ghrelin; L-type calcium channel; Whole-cell patch-clamp;

2014-02-19)

（编辑：常文静）

430060 湖北省武汉市，湖北中医药大学附属医院 湖北省中医院 心内科

杨波 主治医师 硕士 研究方向中西医结合治疗心血管病 Email：yangbotougao@163.com 通讯作者：周承志Email：acheng8341@163.com

R54

A

1000-3614（2014）10-0832-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.10.018

方法： 采用酶解消化法获得大鼠单个心室肌细胞，通过全细胞膜片钳技术研究不同浓度（10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L） Ghrelin对L型钙电流的影响。

结果：10 nmol/L、100 nmol/L及1 μmol/L Ghrelin依次抑制大鼠心室肌细胞L型钙电流峰电位，抑制率分别为：8.95 % ± 2.13%、31.18%±4.78%及64.63% ±8.57%，（ P＜0.05）；I-V曲线上移，通道半数失活电压从（-1.34±1.9） mV分别降至（-8.04±1.32 ）mV、（9.76±1.17 ）mV及（-11.81±0.73）mV（P＜0.05），并延长失活后恢复时间由给药前τ值63.23±9.32，分别增至98.95±10.74、109.56±13.42和127.39±16.13，差异有统计学意义（P＜0.05）。

结论：Ghrelin通过加快L型钙电流的失活及延长失活后恢复时间，具有浓度依赖性地抑制L型钙电流。