钙敏感受体对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制研究*

于晓东，李莹，张凤香

钙敏感受体对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制研究*

于晓东，李莹，张凤香

目的：研究钙敏感受体（CaR）在巨噬细胞中的表达情况及对巨噬细胞转化为泡沫细胞的影响。

钙敏感受体；巨噬细胞 ；CD36；胆固醇酰基转移酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:828.)

动脉粥样硬化（AS）是由多种因素作用产生的复杂的病理变化，其中巨噬细胞的泡沫化转变在AS的发生和发展过程中起到了十分重要的作用。因此，如何抑制巨噬细胞转变为泡沫细胞已经成为了近些年研究的重点。钙敏感受体（calcium-sensing receptor, CaR）是G蛋白偶联受体超家族中C家族的一员，它广泛存在于冠状动脉、肾动脉和主动脉等心血管系统中，并与AS的形成和发展有密切联系[1]。但CaR在巨噬细胞中是否存在表达，以及CaR对巨噬细胞的泡沫化过程是否能产生影响尚知甚少。本实验主要探讨CaR在巨噬中的表达情况，以及对巨噬细胞向泡沫细胞转变的影响。

1 材料和方法

材料：2013-03至2013-09人巨噬细胞（中国科学院上海生物研究所细胞库）；CaR激动剂（GdCl3） 、CaR 抑制剂（NPS2390，上海生工公司）；氧化低密度脂蛋白（oxLDL，北京生物技术公司）；DMEM胎牛血清（美国 Hyclone 公司）；兔抗鼠CaR抗体、兔抗鼠胆固醇酰基转移酶（ACAT-1）单克隆抗体、兔抗鼠CD36单克隆抗体、小鼠抗β-肌动蛋白（β-actin ）单克隆抗体 、HRP 标记山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥公司）；免疫荧光染色试剂盒-FITC（美国Santa Cruz公司）；酶联免疫吸附法（ELISA，试剂盒为美国ADL 公司）。

细胞培养、泡沫化处理及分组：人巨噬细胞置于 37℃水浴中 1 min 内快速复苏，细胞在含20% 胎牛血清的DMEM培养液中培养, 置于37℃、5% CO2 孵箱中，每隔 3～5 天传代一次，细胞密度为1×106个/ml。取对数生长期的细胞，加入100 mg/L ox-LDL培养48 h，诱导泡沫细胞形成。将诱导的泡沫细胞分为3组（各组n=6）：空白对照组；CaR激动剂（GdCl3）组；CaR抑制剂（NPS2390）组。空白对照组只加培养基，而CaR激动剂组和CaR抑制剂组分别加入GdCl3和NPS2390，然后连续培养48 h后，收集各组泡沫细胞备后续实验。

免疫荧光染色检测CaR蛋白的定位表达：巨噬细胞在经4%多聚赖氨酸预处理的盖玻片上培养，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗（NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，Na2HPO43.628 g，溶于800 ml蒸馏水中， pH=7.4），4%的甲醛固定30 min，山羊血清37℃下，封闭30 min；CaR抗体孵育，4℃过夜；PBS冲洗3次；FITC-标记的抗鼠IgG孵育，37℃1 h; 4，6-联脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，2-（4-amidinophenyl）-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI）染核，PBS冲洗3次，荧光显微镜下观察。

油红 O 染色：细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板，待处理好后，用PBS洗3次，60%异丙醇固定1 min，PBS洗1次，油红O染色细胞10 min，PBS洗3 次，每次1 min，苏木素复染2 min，1%盐酸酒精分色1 s，水性封片剂封片。光学显微镜下观察细胞内脂滴[2]。

高效液相色谱（HPLC）分析：用0.9% NaCl离心洗涤2遍，弃上清，加0.9% NaCl 500 μl重悬细胞，冰浴中超声裂解细胞。4℃，15000 g/min，离心10 min，进行蛋白定量。余下上清加入150 μl内标液，涡旋混匀。将混合物分成等量的两份，加入等体积的新鲜配制的15% KOH醇溶液，50℃水浴2 h。然后加正己烷，振荡器上涡旋混匀。取上层有机相在真空干燥机中真空干燥。沉淀中加入丙酮和CrO3。正己烷终止反应，加水混匀，取上层有机相300 μl放于真空干燥机中真空干燥。加入100 μl异丙醇：正庚烷：乙腈（35：12：52，v/v） 将样本溶解，活性碳去色素；超声除气，1500 g/min离心 5 min，收集上清液；取10 μl进样，进行HPLC分析[2,3]。

ELISA 检测：取出实验所需板条，留空白孔。加0.1 ml离心后的细胞培养上清液于反应孔中，置37℃孵育90 min，然后洗板5次。于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1 ml，37℃孵育1 h，洗板5次。加酶结合工作液0.1 ml，37℃避光孵育30 min，洗板5次。加入0.1 ml显色底物液，37℃避光孵育15 min：于各反应孔中加入终止液0.1 ml，混匀后即可测量光密度（OD）450值。

蛋白印迹（Western blot） 检测： 泡沫细胞收集后用PBS洗2次，裂解缓冲液[20 mmol/ L Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl、1% Triton x-100、0.1% 十二烷基磺酸钠（SDS）、1%脱氧胆酸钠、1 mmol/L 依地酸二钠（EDTA）、1 mmol/L PMSF、1 μg/ml aprotinin、1 mmol/L Na3VO4 ]提取细胞总蛋白，BCA试剂盒定量。煮沸变性，每孔加40 μg样本，浓缩胶6%，分离胶10% SDS-PAGE电泳分离，恒压电转移至硝酸纤维素膜, 5%脱脂牛奶封闭1 h。兔抗鼠CaSR（1:3000）、兔抗鼠CD36（1:500）、兔抗鼠ACAT-1（1:1000），4℃过夜。反复洗膜，后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗 IgG 抗体（ 1:1000）孵育，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL发光试剂盒发光显影，凝胶成像。

统计学方法：采用SPSS 13.0 for windows统计软件进行处理。数据以均数±标准差表示，各组数据进行正态性和方差齐性检验，两样本的均数比较采用t检验，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

巨噬细胞中CaR的表达情况： Western blot结果显示，加入CaR抗体的巨噬细胞可见明显条带出现，而未加入CaR抗体的的巨噬细胞未见任何条带（图1A）。免疫荧光结果显示，未加入CaR抗体的巨噬细胞仅见核蓝染（图1B）；而加入CaR抗体的巨噬细胞的胞膜与胞浆内均有特异性绿色荧光，DAPI将核染为蓝色。以上结果说明CaR在巨噬细胞中存在表达。图1B、1C

图1 蛋白印迹和免疫荧光法检测巨噬细胞中CaR的表达情况

高效液相色谱（HPLC）分析各组泡沫细胞胆固醇代谢结果：各组作用细胞48 h后，油红O染色结果显示：空白对照组细胞油红O染色阳性率为（54.12±4.23）%； CaR激动剂组细胞油红O染色阳性率为（21.97±2.04）%； CaR抑制剂组细胞油红O染色阳性率为（87.69±6.67）%。HPLC结果显示：CaR抑制剂组的胆固醇酯、游离胆固醇、总胆固醇、胆固醇酯/总胆固醇值显著高于空白对照组，而CaR激动剂组的胆固醇酯、游离胆固醇、总胆固醇、胆固醇酯/总胆固醇值显著低于空白对照组，差异均有统计学意义 （P＜0. 05） 。表1

表1 高效液相色谱分析各组泡沫细胞胆固醇代谢结果(mg/g, n=6,

表1 高效液相色谱分析各组泡沫细胞胆固醇代谢结果(mg/g, n=6,

注：与空白对照组比较*P＜0.05 。CaR：钙敏感受体

分组 胆固醇酯 游离胆固醇 总胆固醇 胆固醇酯/总胆固醇(%)空白对照组 56.27±5.16 41.96±3.88 72.64±7.42 77.62±6.12 CaR激动剂组 11.02±2.14* 14.36±2.51*26.57±3.62* 41.56±2.67*CaR抑制剂组 81.34±5.97* 59.23±4.16*98.42±9.65*88.81±7.23*

CaR对泡沫细胞上清液中炎性因子分泌的影响：各组作用细胞48 h后，ELISA检测结果显示：与空白对照组比较， CaR激动剂组肿瘤坏死因子-a（TNF-α） 和巨噬细胞游走抑制因子（MIF）水平明显降低，而白介素-10（ IL-10）水平明显升高 （P＜0.05）； CaR抑制剂组 TNF-α和 MIF水平明显升高，而IL-10水平明显降低 （P＜0.05），差异均有统计学意义。表2

表2 CaR对泡沫细胞上清液中炎性因子分泌和CD36、ACAT-1蛋白表达的影响(mg/g, n=6,

表2 CaR对泡沫细胞上清液中炎性因子分泌和CD36、ACAT-1蛋白表达的影响(mg/g, n=6,

注：与空白对照组比较*P＜0.05。ACAT-1胆固醇酰基转移酶。余注见表1

指标 空白对照组 CaR激动剂组 CaR抑制剂组炎性因子肿瘤坏死因子-α 61.31±4.28 43.67±3.76* 79.64±5.03*巨噬细胞游走抑制因子 53.67±4.96 35.21±3.43* 71.44±5.32*白细胞介素-10 56.25±4.66 72.31±4.78* 40.63±4.01*CD36 0.32±0.02 0.21±0.02* 0.49±0.03*ACAT-1 0.59±0.04 0.41±0.03* 0.73±0.04*

CaR对泡沫细胞中CD36和ACAT-1蛋白表达的影响 ：各组作用细胞48 h后，Western blot检测结果显示：与空白对照组比较， CaR激动剂组CD36和ACAT-1蛋白表达明显降低，而CaR抑制剂组CD36和ACAT-1蛋白表达明显升高（P＜0.05），差异均有统计学意义。表2、图2

图2 蛋白印迹检测巨噬细胞中CD36和ACAT-1蛋白的表达

3 讨论

泡沫细胞是由单核巨噬细胞吞噬大量脂质后得以形成的，它是AS的显著特征。泡沫细胞可以通过大量释放游离胆固醇和胆固醇酯，并使其聚集在血管壁的损伤处，从而形成AS斑块的脂质核心。泡沫细胞还可以通过分泌细胞因子、趋化因子和蛋白酶等炎症介质，促进斑块局部发生炎症反应，降低斑块稳定性，引起斑块破裂和脱落，最终导致缺血性心血管疾病的形成[4]。

本研究通过Western blot检测发现在巨噬细胞内CaR抗体组出现170 kD特异性条带，而阴性对照组无任何条带出现。免疫荧光染色显示，CaR蛋白定位在巨噬细胞的胞膜和胞浆。以上结果说明巨噬细胞内有CaR的表达。研究表明CaR在AS的形成和发展中起重要作用。因此，本实验进一步研究CaR对巨噬细胞泡沫化的影响。本研究发现；与空白对照组比较，CaR激动剂组的细胞阳性率和总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯值均明显降低，而CaR抑制剂组的细胞阳性率和总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇酯值均明显升高。该结果说明当CaR的表达增强时巨噬细胞向泡沫细胞的转化被明显抑制。TNF-α可以通过损伤内皮细胞、促进凝血和抑制纤溶等作用来促进AS的形成[5,6]。MIF可以通过抑制巨噬细胞的游走和促进巨噬细胞在炎性反应区域的聚集、增生和分 泌细 胞 因 子等作用来促进AS的形成[7]。而 IL-10则可以通过抑制单核巨噬细胞合成及释放各种炎性因子和抑制炎性细胞的黏附、浸润等作用来抑制AS的形成[8]。本研究发现，与空白对照组比较，CaR激动剂组TNF-α和MIF 水平明显降低，而IL-10水平明显升高；CaR抑制剂组TNF-α和MIF水平明显升高，而 IL-10水平明显降低。该研究结果说明， 高表达的CaR具有促进抗炎因子分泌和抑制促炎因子分泌的作用。CD36是单核巨噬细胞表面的一种清道夫受体，巨噬细胞可以通过CD36摄取大量ox-LDL形成泡沫细胞，进而影响AS的形成[9-11]。ACAT-1可以使细胞内游离胆固醇转变为胆固醇酯，而大量蓄积的胆固醇酯则可以使巨噬细胞转变为泡沫细胞[12]。本研究结果显示，与空白对照组比较，CaR激动剂组CD36和ACAT-1蛋白表达明显降低，而CaR抑制剂组CD36和ACAT-1蛋白表达明显升高。该研究结果说明，高表达的CaR可以通过下调泡沫细胞形成基因CD36和ACAT-1蛋白表达来抑制巨噬细胞内脂质的蓄积。

综上,巨噬细胞中存在CaR的表达，并且CaR的表达变化可以影响巨噬细胞泡沫化的形成，但其具体机制还需做进一步的研究。

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Effect of Calcium-sensing Receptor on Human Macrophages Converting to Foam Cells With its Mechanisms

YU Xiao-dong, LI Ying, ZHANG Feng-xiang.
Department of Cardiac Surgery, First Aff i liated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou (121001), Liaoning, China

ZHANG Feng-xiang, Email: zhangfengxiang64@163.com

Objective: To study the expression of calcium-sensing receptor (CaR) in human macrophages and the effect of CaR on macrophages converting to foam cells with its mechanism.Methods: Human macrophages were treated with ox-LDL (100 mg/L) for 48 h to induce foam cell formation, the experimental foam cells were cultured in 3 groups for 48 h respectively. Blank control group, Foam cell + CaR agonists (Agonists) group and Foam cell + CaR inhibitor (Inhibitor) group. The CaR expression in macrophages was measured by immuno-fluorescence and Western blot analysis. The positive foam cell formation was detected by oil red O staining, the intracellular cholesterol metabolism in foam cell was observed by HPLC, the inf l ammatory cytokine secretion in foam cell culture supernatant was examined by ELISA, the protein expressions of CD36 and acyl-coA: cholesterol acyl-transferase (ACAT-1) in foam cells was measured by Western blot analysis.Results: Immuno-f l uorescence and Western blot indicated CaR is expressed in human macrophages. Compared with Control group, Oil Red O staining and HPLC showed that Agonists group had less positive foam cell formation, decreased CE, FC , TC, and Inhibitor group had more positive foam cell formation, increased CE, FC, TC, all P＜0.05; ELISA presented that Agonists group had decreased TNF-α, MIF, increased anti-inflammatory cytokine IL-10, and Inhibitor group had increased TNF-α, MIF, decreased IL-10, all P＜0.05; Western blot analysis indicated that Agonists group had decreased protein expressions of CD36, ACAT-1in foam cells, and Inhibitor group had increased protein expressions of CD36 and ACAT-1.Conclusion: CaR is expressed in human macrophages, the higher CaR expression may inhibit macrophages converting to foam cells.

Calcium-sensing receptor; Macrophages; CD36; Acyl coA: cholesterol acyl-transferase

2014-01-16)

（编辑：梅平）

辽宁省自然科学基金（2013022010）；辽宁医学院青年科技启动基金项目 (XZJJ20130246) ；辽宁医学院附属第一医院青年科技启动基金项目 (FY2012-07)

121001 辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院 心外科

于晓东 硕士研究生 主要从事动脉粥样硬化研究 Email: canghaiguanri@126.com 通讯作者：张凤香 Email: zhangfengxiang64@163.com

R541

A

1000-3614（2014）10-0828-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.10.017

方法: 通过免疫荧光和蛋白印迹（Western Blot）检测巨噬细胞中CaR的表达情况；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）100 mg/L作用48 h，使巨噬细胞转化为泡沫细胞；实验分组为CaR激动剂组、CaR抑制剂组、空白对照组，分别作用泡沫细胞48 h：采用油红O染色检测阳性细胞数量；高效液相色谱观察细胞内胆固醇代谢情况；酶联免疫吸附法（ ELISA）检测细胞上清液中炎性因子的分泌情况；Western blot检测细胞内CD36和胆固醇酰基转移酶（ACAT-1）蛋白的表达情况。

结果: Western blot和免疫荧光结果显示在巨噬细胞中存在CaR的表达。油红O染色和高效液相色谱检测泡沫细胞的结果显示：与空白对照组比较，CaR激动剂组阳性细胞数量和胆固醇酯、游离胆固醇、总胆固醇的含量均明显下降（P＜0.05），而CaR抑制剂组阳性细胞数量和胆固醇酯、游离胆固醇、总胆固醇的含量均明显升高（P＜0.05）；ELISA 检测结果显示：与空白对照组比较，CaR激动剂组促炎因子肿瘤坏死因子-（TNF- a）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）含量明显降低（P＜0.05），抗炎因子白细胞介素-10（IL-10） 含量明显升高（P＜0.05），而CaR抑制剂组促炎因子TNF- a、 MIF 含量明显升高（P＜0.05），抗炎因子IL-10含量明显降低（P＜0.05）；Western blot检测各组泡沫细胞结果发现：与空白对照组比较，CaR激动剂组CD36和ACAT-1蛋白表达明显下降，而CaR抑制剂组CD36和ACAT-1蛋白表达明显升高。

结论: 在巨噬细胞中存在CaR的表达，并且高表达的CaR可以抑制巨噬细胞泡沫化的形成。