花椒籽仁油多不饱和脂肪酸乙酯的制备及氧化稳定性研究

边凤霞，姚世勇，刘 荣，殷钟意，郑旭煦，，*

（1.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆400067；2.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室，重庆400067）

花椒籽仁油多不饱和脂肪酸乙酯的制备及氧化稳定性研究

边凤霞1，姚世勇1，刘 荣1，殷钟意2，郑旭煦1，2，*

（1.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆400067；2.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室，重庆400067）

为提高花椒籽仁油的降脂活性和氧化稳定性，将其制备成富含α-亚麻酸乙酯的多不饱和脂肪酸乙酯（PUFAEE）。以自制的花椒籽仁油为原料，以α-亚麻酸乙酯产率为检测指标，优化碱催化法制备混合脂肪酸乙酯的工艺，利用硝酸银络合法分离纯化出PUFAEE，测定其氧化诱导时间（OIP）。结果表明，在乙醇钠用量为0.5%（wt%）、醇油体积比为6∶1、反应温度为60℃、反应时间为60min的条件下制备混合脂肪酸乙酯，α-亚麻酸乙酯产率达94.69%；分离纯化的PUFAEE富含α-亚麻酸乙酯（76.9%），氧化稳定性好，其OIP为（5.39±0.07）h，远远高于花椒籽仁油的OIP（0.62± 0.05）h；芝麻酚可作为花椒籽仁油及其PUFAEE的抗氧化剂，其强化作用呈现一定的量效关系。

花椒籽仁油，多不饱和脂肪酸乙酯，制备，氧化稳定性，氧化诱导时间

大量实验研究已经证明，多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）尤其是n-3系PUFA对高脂血症和心血管疾病有明显的预防和治疗作用，但其食用量并非越多越好，这是因为PUFA结构中的不饱和双键在代谢过程中易形成脂质过氧化产物，尤其是使用高剂量的n-3系PUFA可通过细胞和亚细胞膜的自由基链反应导致氧化损伤[1-3]。花椒籽仁油（Zanthoxylum seed kernel oil，ZSKO）不饱和脂肪酸含量高达90%，PUFA含量约70%，n-6系亚油酸（linoleic acid，LA）与n-3系α-亚麻酸（α-Linolenicacid，ALA）的比例接近1∶1[4]，因此花椒籽仁油对实验性高脂血症大鼠具有调节血脂、改善血流和防止脂质过氧化作用[5]。然而，花椒籽仁油的降脂作用与他汀类阳性药相比还存在较大差距，若要提高其降脂活性，就需要对其PUFA进行纯化。由于植物油脂中以甘油三酯型式存在的PUFA很难提纯，以脂肪酸型式存在的PUFA极不稳定，而以单酯型式存在的PUFA具有易于人体吸收、无毒副作用、易蒸馏分离和氧化稳定性好等特点[6]，本课题组尝试将花椒籽仁油转化为以单酯型式存在的混合脂肪酸乙酯，然后利用硝酸银络合法分离纯化出富含α-亚麻酸乙酯（α-Linolenic acid ethyl ester，ALAEE）的多不饱和脂肪酸乙酯（Polyunsaturated fatty acid ethyl ester，PUFAEE），研究高含量n-3系PUFAEE的氧化稳定性及降脂活性，为花椒籽仁油PUFAEE保健品的开发应用奠定理论基础。

将油脂中的甘油三酯转化为脂肪酸乙酯，常见的方法包括酸催化法、碱催化法和酶催化法等[7-9]。基于碱催化法具有反应迅速、温度较低、产率较高等特点，本文采用油脂与无水乙醇在碱性催化剂（乙醇钠）下发生酯交换反应的方法，将花椒籽仁油转化为混合脂肪酸乙酯，并且优化酯交换反应的工艺；然后采用硝酸银络合法进行分离纯化[10-11]；最后以花椒籽仁油为对照，采用Rancimat仪测定氧化诱导时间（oxidative induction period，OIP），研究富含ALAEE的PUFAEE的氧化稳定性以及天然抗氧化剂对其的强化作用情况[12-16]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大红袍花椒籽 购自陕西省韩城市；无水甲醇（色谱纯） 由Sigma公司提供；ALAEE、无水乙醇、无水乙醇钠、磷酸、KOH、NaOH 均为分析纯；维生素E、β-谷甾醇、芝麻酚等天然抗氧化剂 均为食品级。

7820A型Agilent 1260液相色谱 美国Agilent公司；D-37520型高速冷冻离心机（Biofuge Stratos D-37520 Osterode）；873型Biodiesel Rancimat氧化测定仪 瑞士万通中国有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花椒籽仁油的制取 大红袍花椒籽与过量的质量百分数为1.4%的氢氧化钠溶液混合，于氮气保护中，在温度为60℃的条件下加热30min，过滤，得到去除表皮油脂的花椒籽；然后以去除表皮油脂花椒籽为原料，采用螺旋压榨机经三次控温（低于60℃）压榨后制取花椒籽仁油毛油；最后通过离心（10000r/min，10min）、固液分离（取油脂层）、冷冻（-5℃）离心等步骤获得精制后的花椒籽仁油[17]。

1.2.2 花椒籽仁油混合脂肪酸乙酯的制备工艺及其优化

1.2.2.1 制备工艺 按照一定的醇油比将无水乙醇与花椒籽仁油混合，先加热至一定温度，然后加入一定量乙醇钠（催化剂）至溶液澄清透明，反应一段时间后加入蒸馏水终止反应，冷却至室温，静置分层，分离出混合脂肪酸乙酯[18]。采用液相色谱仪测定混合脂肪酸乙酯中ALAEE含量，计算ALAEE的产率。ALAEE产率按下式计算：

式中：P为产物中ALAEE的质量（g）；R为花椒籽仁油中的ALA全部转化为ALAEE的理论质量（g）。

1.2.2.2 单因素实验设计 a.乙醇钠用量的确定：在反应温度为60℃、反应时间为50min、醇油比为4∶1条件下，考察乙醇钠用量（0.3%、0.4%、0.5%、0.8%、1.2%）对ALAEE产率的影响。

b.醇油体积比的确定：在反应温度为60℃、反应时间为50min、催化剂用量为0.5%（wt%）条件下，考察醇油体积比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1）对ALAEE产率的影响。

c.反应时间的确定：在催化剂用量为0.5%（wt%）、醇油体积比为5∶1、反应温度为60℃的条件下，考察酯化反应时间（20、40、60、120、180min）对ALAEE产率的影响。

d.反应温度的确定：在催化剂用量为0.5%（wt%）、醇油体积比为5∶1、反应时间为60min的条件下，分别考察反应温度（30、40、50、60、75℃）对ALAEE产率的影响。

1.2.2.3 正交实验设计 采用L9（34）正交实验表对花椒籽仁油混合脂肪酸乙酯的制备工艺进行优化，考察乙醇钠用量、醇油体积比、反应时间和反应温度等因素对ALAEE产率的影响，因素与水平见表1。

表1 ALAEE制备正交实验因素与水平表Table 1 Factors and levels involved in optimizing prepar mixed fatty acid ethyl ester

1.2.3 ALAEE含量的测定 ALAEE含量测定的液相色谱分析条件为：C18反相色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱温：25℃；检测波长：210nm；流动相：甲醇∶0.1%磷酸=90∶10；流速：0.5mL/min；进样量：10μL。

1.2.4 花椒籽仁油PUFAEE的分离纯化 在避光条件下，将1.2.2制取的混合脂肪酸乙酯与等体积的4mol/L硝酸银溶液在0℃混合，搅拌90min，静置分层，分离出硝酸银层，用石油醚萃取，取醚层，重复用硝酸银溶液络合3次，合并石油醚液，蒸去石油醚，即可得到富含ALAEE的花椒籽仁油PUFAEE[19]。

1.2.5 花椒籽仁油PUFAEE的氧化稳定性及其强化

以花椒籽仁油为对照，在不断通入空气（10L/h）的条件下，用873型Biodiesel Rancimat氧化测定仪于110℃下测定花椒籽仁油及其PUFAEE的氧化诱导时间（OIP）[20]，平行测定三次，比较二者的氧化稳定性。同时，比较VE、β-谷甾醇、芝麻酚等天然抗氧化剂[21]（添加量均为0.1%，wt%）对花椒籽仁油及其PUFAEE氧化诱导时间（OIP）的影响，并考察芝麻酚添加量（0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%）对花椒籽仁油及其PUFAEE的OIP的影响。

2 结果与讨论

2.1 花椒籽仁油的脂肪酸含量及理化指标

按照1.2.1方法制取压榨花椒籽仁油，出油率为20.2%；经重庆市食品工业研究所检测，其主要脂肪酸含量分别为：油酸24.9%、亚油酸29.9%、α-亚麻酸34.0%，主要理化指标为：酸值0.29mg/g、水分及挥发物0.017%，表明制取的花椒籽仁油能满足碱催化酯交换反应的要求。

2.2 花椒籽仁油混合脂肪酸乙酯的制备工艺研究

2.2.1 单因素实验结果及分析

2.2.1.1 乙醇钠用量的确定 ALAEE产率随乙醇钠用量变化的实验曲线如图1所示。

图1 乙醇钠用量对ALAEE产率的影响Fig.1 Effect of additive amount of sodium ethylate on the yield of ALAEE

由图1可知，在乙醇钠用量达到0.5%之前，ALAEE产率随着乙醇钠用量的增加而迅速增大，当乙醇钠用量超过0.5%时，ALAEE产率略微下降并趋于平缓。这是因为压榨花椒籽仁油中含有少量游离脂肪酸，加入的乙醇钠一部分将与游离脂肪酸反应，生成脂肪酸乙酯，导致反应初期ALAEE产率迅速增大；当乙醇钠用量超过0.5%时，将引起皂化反应，致使ALAEE产率下降。因此本文选取适宜的乙醇钠用量为0.5%（wt%）。

2.2.1.2 醇油体积比的确定 ALAEE产率随醇油体积比变化的实验曲线如图2所示。

图2 醇油体积比对ALAEE产率的影响Fig.2 Effect of volume ratio of alcohol and oil on the yield of ALAEE

由图2可知，ALAEE产率随醇油体积比的增加呈现先增大后小幅减小的变化趋势；当醇油体积比超过6∶1时，ALAEE产率随着醇油体积比的增加而减小，可能原因是无水乙醇含量过高，有机相和水相的密度差减小，导致甘油分离困难。由于醇油体积比由5∶1增加到6∶1时，ALAEE产率仅增加1.66%，增幅很小，且醇油体积比过大将带来产品分离难度加大和溶剂损耗等问题，因此本文选择适宜的醇油体积比为5∶1。

2.2.1.3 反应时间的确定 ALAEE产率随反应时间变化的实验曲线如图3所示。

图3 反应时间对ALAEE产率的影响Fig.3 Effect of reaction time on the yield of ALAEE

分析图3可知，反应初期，随着反应时间的增加，ALAEE产率增大；当反应时间达60min时，ALAEE产率达到最高；此后随着反应时间的增加，产率略有下降。可能因为反应时间超过60min后，随着时间的延长，部分花椒仁油和混合脂肪酸乙酯在催化剂作用下发生皂化反应，使α-亚麻酸乙酯含量减少，ALAEE产率降低。故本文选择适宜的反应时间为60min。

2.2.1.4 反应温度的确定 ALAEE产率随反应温度变化的实验曲线如图4所示。

图4 反应温度对ALAEE产率的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on the yield of ALAEE

由图4可知，ALAEE产率随反应温度的升高呈先增加后减小的变化趋势；当反应温度大于60℃，ALAEE产率开始下降，可能的原因是反应温度过高而引起原料变质和反应方向逆转，以及乙醇挥发加速，引起反应体系醇油体积比降低，导致ALAEE产率降低。因此，本文选择适宜的反应温度为60℃。

2.2.2 正交实验结果及分析 正交实验结果见表2。

表2 正交实验数据及结果Table 2 Orthogonal array design and experimental results

由表2可知，影响花椒籽仁油乙酯化的因素从主到次的顺序依次为：A＞C＞B＞D，即反应温度对ALAEE产率影响最大，是花椒籽仁油乙酯化过程中最重要的因素，其次是乙醇钠用量和反应时间，醇油体积比在所考察的范围内影响最小。根据k值可知最优组合为A2B2C2D3。

2.2.3 最优水平验证实验 由于表2中未涉及正交实验优化组合A2B2C2D3实验结果，因此需要进行验证实验。验证实验结果显示，A2B2C2D3组合的ALAEE产率为94.69%。即最优工艺条件为：反应温度60℃，反应时间60min，乙醇钠用量0.5%，醇油体积比6∶1，在此条件下，ALAEE产率为94.69%。

2.3 花椒籽仁油PUFAEE的分离纯化

以2.2所得的混合脂肪酸乙酯为原料，采用1.2.4所述的硝酸银络合法分离纯化出富含ALAEE的PUFAEE，其中α-亚麻酸乙酯和亚油酸乙酯含量分别为76.9%、13.9%，为高含量n-3系PUFAEE。花椒籽仁油PUFAEE的液相色谱图如图5所示。

图5 花椒籽仁油PUFAEE的液相色谱图Fig.5 Chromatogram of polyunsaturated fatty acid ethyl ester from Zanthoxylum seeds kernel oil

2.4 花椒籽仁油PUFAEE的氧化稳定性及其强化

2.4.1 PUFAEE与花椒籽仁油的氧化稳定性比较 在110℃并通入空气的条件下，测得PUFAEE和花椒籽仁油的氧化诱导时间（OIP）分别为（5.39±0.07）h和（0.62±0.05）h。表明将花椒籽仁油制成富含ALAEE的PUFAEE，其氧化稳定性得到大幅提升，提示该PUFAEE将具有降血脂和防止脂质过氧化作用（将再另文报道动物实验结果）。

2.4.2 抗氧化剂对花椒籽仁油及其PUFAEE氧化稳定性的强化 图6列出了维生素E、β-谷甾醇（sitosterol）、芝麻酚（Sesamol）等天然抗氧化剂对花椒籽仁油及其PUFAEE氧化稳定性的强化作用情况。

图6 抗氧化剂对花椒籽仁油及其PUFAEE的氧化稳定性的影响Fig.6 Effect of some antioxidants on the oxidation stability of ZSKO and PUFAEE

由图6可知，在抗氧化剂添加量为0.1%（wt%）条件下，VE和β-谷甾醇对花椒籽仁油及其PUFAEE的氧化稳定性的强化作用很小，而芝麻酚对花椒籽仁油及其PUFAEE的强化作用较大，提示芝麻酚可作为花椒籽仁油及其PUFAEE的抗氧化剂，以延长其货架保存期。另外，上述抗氧化剂对花椒籽仁油的强化顺序依次为芝麻酚＞VE＞β-谷甾醇，对PUFAEE的强化顺序依次为芝麻酚＞β-谷甾醇＞VE，其间的微小差异可能缘于VE和β-谷甾醇分别在花椒籽仁油及其PUFAEE中的溶解度差异。

2.4.3 芝麻酚添加量对花椒籽仁油及其PUFAEE氧化稳定性的影响 以芝麻酚作为花椒籽仁油及其PUFAEE的抗氧化剂，考察其添加量对其氧化稳定性的影响，结果见图7。

由图7可知，花椒籽仁油及其PUFAEE的OIP随着芝麻酚添加量的增加而逐渐增大，且前者的增大幅度大于后者。表明添加一定量的芝麻酚可有效提高花椒籽仁油及其PUFAEE的氧化稳定性，并且芝麻酚对花椒籽仁油的强化作用大于对PUFAEE的强化作用。

3 结论

3.1在乙醇钠用量为0.5%（wt%）、醇油体积比为6∶1、反应温度为60℃、反应时间为60min的条件下制备混合脂肪酸乙酯，α-亚麻酸乙酯产率达94.69%。

图7 不同芝麻酚添加量对花椒籽仁油及其PUFAEE的氧化稳定性的影响Fig.7 Effect of different additive percentage of Sesamol on the oxidation stability of ZSKO and PUFAEE

3.2以混合脂肪酸乙酯为原料，采用硝酸银络合法分离纯化出PUFAEE，其中α-亚麻酸乙酯、亚油酸乙酯含量分别达76.9%、13.9%，为富含α-亚麻酸乙酯的PUFAEE。

3.3PUFAEE的氧化稳定性高，其OIP达（5.39±0.07）h，远远高于花椒籽仁油的OIP（0.62±0.05）h；芝麻酚可作为花椒籽仁油及其PUFAEE的抗氧化剂，其强化作用呈量效相关。

[1]SCISLOWSKI V，BANCHART D，GRUFAT D，et al.Efect of dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids on poroxidizability of lipoproteins in steers[J].Lipids，2005，40（12）：1245-1246.

[2]Nirmala K，Prasanna K，Kalpagam P.Alterations in antioxidant status of rats following intake of ginger through diet[J].Food Chemistry，2007，106：991-996.

[3]禹晓，邓乾春，黄凤洪，等.不同α-亚麻酸含量油脂对高脂模型大鼠脂质水平及氧化损伤的影响[J].营养学报，2011，33（2）：129-137.

[4]郑旭煦，殷钟意，杜若愚，等.同种溶剂两步浸提法分离提取花椒籽皮油和仁油[J].食品科学，2010，31（22）：180-184.

[5]刘永英，王多宁，刘渊声，等.花椒籽仁油对实验性高脂血症大鼠的防治作用[J].第四军医大学学报，2007，28（5）：411-413.

[6]ARMENTA R E，VINATORU M，BUR JA A M，et al. Transesterification of fish oil to produce fatty acid ethyl estersusing ultrasonic energy[J].Jam oil Chem Sic，2007，84：1045-1052.

[7]侯继贤，鲁吉珂，聂开立，等.固定化Candida sp.99-125脂肪酶催化大豆油合成脂肪酸乙酯[J].过程工程学报，2008，8（2）：355-358.

[8]刘润哲，彭桦，梅连平，等.脂肪酸乙酯的制备与纯化[J].粮食与食品工业，2010，5（17）：22-25.

[9]ZHOU WY，KONAR S K，BOOCOCK D G B.Ethyl esters from the single phase base-catalyzed ethanolysis of vegetable oils[J].Jam oil Chem Sic，2003，80：367-371.

[10]陈伟珠，洪专，赵敏，等.鱼油中二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯的超临界流体色谱分离技术[J].食品科学，2012，33（24）：82-85.

[11]唐君，张春枝，吴文忠.一种鱼油中EPA和DHA富集的新方法[J].大连工业大学学报，2008，27（2）：102-104.

[12]周晓丹，王妍，刘晶，等.橄榄油、葵花籽油和米糠油的氧化稳定性[J].食品科学，2011，32（13）：119-121.

[13]CHRISTIAN G，SABINE K，PARKASH K S.Testing and comparing oxidative stability of vegetable oil and fats at frying temperature[J].European Journal of Lipid Science and Technology，2000，102（8/9）：543-551.

[14]NAZ S，SHEIKH H，SIDDIQI R，et al.Oxidative stability of olive，corn and soybean oil under different conditions[J].Food Chemistry，2004，88（2）：253-254.

[15]TONU P，REGINA P，PIRET R，et al.Inhibition of lipid oxidation and dynamics of polyphenol content in mechanically deboned meatsupplementwith sea buckthorn（Hippophae rhamnoides）berry residues[J].Food Chemistry，2008，107：714-716.

[16]李瑞贞，刘玉环，周厚德，等.光皮树油氧化稳定性的研究[J].食品科学，2009，30（21）：87-89.

[17]边凤霞，郑旭煦，殷钟意，等.压榨花椒籽仁油的制备及氧化稳定性[J].食品科学，2013，34（16）：46-50.

[18]夏辉，鲁海龙.元宝枫油乙酯制备工艺[J].中国油脂，2010，35（6）：26-28.

[19]蒋艳忠，胡小明，杨克迪.硝酸银络合法浓缩蚕蛹油中α-亚麻酸的研究[J].食品工业科技，2008，29（4）：205-209.

[20]邓乾春，黄庆德，黄凤洪，等.亚麻籽油调和油的热稳定性研究[J].食品科学，2012，33（5）：88-92.

[21]黄克，崔春，赵谋明，等.天然抗氧化剂的增效作用及其对花生油抗氧化效果研究[J].现代食品科技，2012，28（9）：1139-1141.

Study on preparation and oxidation stability of polyunsaturated fatty acid ethyl ester from Zanthoxylum seeds kernel oil

BIAN Feng-xia1，YAO Shi-yong1，LIU Rong1，YIN Zhong-yi2，ZHENG Xu-xu1，2，*
（1.Environmental and Biological Engineering Institute，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China；2.Chongqing Key Lab of Catalysis&Functional Organic Molecules，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China）

In order to improve the lipid-lowering activity and oxidation stability of Zanthoxylum seed kernel oil，the polyunsaturated fatty acid ethyl ester（PUFAEE）being rich in α-linolenic acid ethyl ester was prepared. Using self-made Zanthoxylum seed kernel oil as raw material，with the yield of α-linolenic acid ethyl ester as detection index，the process preparing mixed fatty acid ethyl ester by using alkali catalyzed method was optimized，PUFAEE was separation and purification by using silver nitrate complexation method，and its oxidative induction period（OIP）was determined.The results showed that the mixed fatty acid ethyl ester was prepared and the yield of α-linolenic acid ethyl ester was 94.69%when the sodium ethylate was 0.5%（wt%），the volume ratio of alcohol and oil was 6∶1，the reaction temperature was 60℃and the reaction time was 60min. The prepared PUFAEE were rich in α-linolenic acid ethyl ester（76.9%），its oxidation stability was good，its OIP was（5.39±0.07）h，far higher than the OIP of Zanthoxylum seed kernel oil（0.62±0.05）h.Sesamol could be used as antioxidant of Zanthoxylum seed kernel oil and their PUFAEE，their strengthening effect showed a doseresponse relationship to some degree.

Zanthoxylum seed kernel oil；polyunsaturated fatty acid ethyl ester；preparation；oxidation stability；oxidative induction period

TS222

B

1002-0306（2014）10-0264-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.050

2013－07－31 *通讯联系人

边凤霞（1987-），女，硕士研究生，助教，主要从事环境生物工程方面的研究。

重庆市科技攻关项目（CSTC2011AB5007）；重庆高校创新团队建设计划（KJTD201020）。