瓜蒌籽中脂肪酸组成型态及抗氧化活性

赵小云，管中华，李齐激，王道平，杨小生，*

（1.贵州大学药学院，贵州贵阳550002；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002）

瓜蒌籽中脂肪酸组成型态及抗氧化活性

赵小云1，2，管中华2，李齐激2，王道平2，杨小生1，2，*

（1.贵州大学药学院，贵州贵阳550002；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002）

采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，结合甲基化处理方法，对瓜蒌籽油中总脂肪酸、结合态脂肪酸（脂肪）和游离脂肪酸进行分析测试，并对其自由基清除能力进行了研究。结果显示：瓜蒌籽富含油脂，出油率达52%，其中以结合态脂肪酸为主，占总脂肪酸的99%；不饱和脂肪酸占总脂肪酸的83.3%，主要成分为亚油酸、油酸和亚麻酸；抗氧化活性实验表明，当瓜蒌籽油在浓度为1.0mg/mL时，对羟基自由基清除率达95.0%，其对羟基自由基的清除率具有量效关系。因此，瓜蒌籽油为一种富含结合态不饱和脂肪酸的植物油，可作为功能性食用油脂来开发利用。

瓜蒌籽，结合态脂肪酸，抗氧化活性

瓜蒌来源于葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Marim的果实，主产地山东、河南、河北[1]，现已在贵州省绥阳县兆福农业科技有限公司引种栽培超过3000亩，未来几年将达万亩的种植规模，是重要的经济药材之一。其种子、果皮、根均可入药，具有清热化痰，宽胸散结、润燥滑肠、痛疮肿毒等功效，主治热病口渴，消渴多饮，肺热燥咳，疮疡肿毒。文献报道瓜蒌籽含有的大量的油脂类成分，且其还含有蛋白质、氨基酸、微量元素及多种维生素[2]等，其脂肪酸的主要成分为亚油酸，该成分是在人体内不能自行合成，必需通过体外摄取的不饱和脂肪酸[3]，具有抗血栓、降血脂、降胆固醇、促进大脑发育、改善或保护血管壁，防止动脉粥样硬化等药理作用[4]。但瓜蒌籽油中脂肪酸的结合型态、抗氧化活性（自由基清除）的研究尚未见报道。

近年来，植物油脂，特别是富含不饱和脂肪酸的植物油脂，在食品、保健食品中的应用，受到广泛关注。本文对栽培品种瓜蒌籽总脂肪酸中结合态脂肪酸和游离脂肪酸的含量和组分分析以及抗氧化活性进行研究，为有效开发利用该资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

瓜蒌籽 由贵州省绥阳县兆福农业科技有限公司提供，经贵阳中医学院孙庆文副教授鉴定为括楼Trichosanthes kririlowii Marim的种子；二苯代苦味基肼自由基（DPPH·） 百灵威公司；抗坏血酸（VC）、橄榄油 上海润捷化学试剂有限公司，20041101；石油醚（沸程30～60℃）、甲醇、正己烷、氯化钠、无水硫酸镁、浓硫酸、无水乙醇、H2O2、硫酸亚铁、邻二氮菲、氢氧化钾、碳酸钠、浓盐酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 均为国产分析纯。

HP6890/HP5975C型GC/MS联用仪 美国安捷伦公司；HP-8453型紫外可见分光光度计 惠普公司；FA114型电子天平 上海海康电子仪器厂；EYELA型旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；恒温水浴锅 上海申生科技有限公司；DZ-2A型真空干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 瓜蒌子油的提取[5]取瓜蒌籽12g，去其种皮，在研钵中快速研磨，然后置于索氏提取器中连续回流提取，提取条件：温度45℃，溶剂石油醚，提取时间3h（两次），料液比1∶10。真空浓缩，得到的瓜蒌籽油在常温下干燥至恒重后，称重计算出油率。出油率可按下式公式计算[6]：

式中：Y-出油率；W1-提取瓜蒌籽油重量，g；W2-瓜蒌籽重量，g。

1.2.2 GC-MS分析

1.2.2.1 供试品的制备[7-8]总脂肪酸供试品的制备：取瓜蒌籽油50mg置于容量瓶中，加1mL硫酸-甲醇溶液（2.5mol/L），70℃水浴反应30min，冷却后加2mL正己烷，取上清液即得GC-MS分析用总脂肪酸供试品。

结合态脂肪酸供试品的制备：取瓜蒌籽油580mg置于分液漏斗中，加入100mL 5%的Na2CO3水溶液，摇匀，再用100mL正己烷萃取，正己烷层用水洗至中性后加无水MgSO4干燥滤过，真空浓缩得结合态脂肪酸532mg，从中取50mg置于反应瓶中，加入1mL氢氧化钾-甲醇溶液（2.5mol/L），在50℃水浴中反应30min后，加入正己烷萃取后即得GC-MS分析用结合态脂肪酸供试品。

游离脂肪酸的制备：取结合态脂肪酸供试品的制备项下的Na2CO3水层，先用2mol/L HCl酸化，再用正己烷萃取，正己烷层用水洗至中性后加无水MgSO4干燥滤过，真空浓缩得游离脂肪酸5.4mg。按如上总脂肪酸供试品的制备方法进行制备，即得GC-MS分析用游离脂肪酸供试品。

据此也可求得结合型脂肪酸和游离脂肪酸的比例，可按下式计算：

结合型脂肪酸∶游离脂肪酸=W1∶W2

式中：W1-制备所得结合型脂肪酸的重量，g；W2-制备所得游离脂肪酸的重量，g

1.2.2.2 GC-MS分析条件 气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS 5%Phenyl Sloane（30m×0.25mm×0.25mm）弹性石英毛细管柱，柱温45℃（保留时间2min）。以3.5℃/min速度升温至220℃，保持2min。汽化室温度250℃，载气为高纯He（99.999%），柱前压7.62psi，载气流量1.0mL/min，分流比20∶1。

质谱检测条件 离子源为EI源；离子源温度280℃；四级杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6UA；倍增器电压1037V；接口温度280℃；质量范围30～50amu。

通过HPMSD化学工作站，结合WILEY275和NIST2005质谱标准图库，通过峰面积归一化法按下式进行计算，求得各化学成分的相对含量，即某组分的色谱峰面积在总色谱峰面积中所占的比例。

1.2.3 抗氧化活性测定方法

1.2.3.1 羟基自由基清除率的测定 测定方法采用Fenton反应[9-10]。参照史亚男等[11]学者的方法，并略作改进。取1mL 0.75mmol/L的邻二氮菲溶液（无水乙醇配制），加2mL 0.2mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.4），充分混匀后加入1mL 0.75mmol/L的硫酸亚铁溶液（去离子水配制），每加一管立即混匀，加入1mL浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的样品溶液，最后加入1mL 0.01%H2O2，于37℃保温1h，536nm处测定吸光度为A处理。将体系中的样品改为加入1mL蒸馏水，测定得A对照。空白对照不加0.01%H2O2，以蒸馏水补充体积，测定得A空白对照。每个质量浓度样品做3个平行样品，取平均值。羟基自由基的清除率计算公式如下：

清除率（%）=（A536处理-A536对照）/（A536空白对照-A536对照）×100

1.2.3.2 DPPH清除率的测定[12-13]称取一定量的瓜蒌籽油，分别用无水乙醇配成浓度为5、10、20、40、60、80、100mg/mL，取2mL样品溶液，加入2mL 0.2mmol/mL的DPPH溶液，摇匀，于25℃水浴中加热15min后，以无水乙醇调零，测定517nm处的吸光值Ai；取2mL无水乙醇代替样品溶液测得空白吸光度A0；以2mL样品溶液中加入2mL无水乙醇，测得样品本体吸光度Aj。同一测定重复3次，取平均值。按下式计算清除率：

清除率（%）=[A0-（Ai-Aj）/A0]×100

2 结果与分析

2.1 瓜蒌籽出油率及类型

通过连续回流提取法所得瓜蒌籽油呈亮浅黄色，澄清无沉淀，出油率为52%；结合态脂肪酸与游离脂肪酸之比为98.5∶1。不饱和脂肪酸占总脂肪酸的83.3%。由此，瓜蒌籽中富含油脂，且以结合态脂肪酸为主，占总脂肪酸的99%。

2.2 瓜蒌籽油脂肪酸组成GC-MS分析

取1.2.2.1项下制备的供试品1000倍稀释液1μL，在1.2.2.2气相色谱-质谱联用仪分析条件下进行分析鉴定。进样后，延迟20min采集图谱，得到的瓜蒌籽脂肪酸甲酯化成分总离子色谱图，见图1～图3。（注：图1～图3上各色谱峰的编号分别对应表1中的序号）

由表1可知，瓜蒌籽总脂肪酸的甲酯化物中共检测鉴定出11个化合物，占其色谱峰总面积的99.6%，不饱和脂肪酸占82.5%，主要成分为亚油酸甲酯（31.302%）、（Z）-9-十八碳烯酸甲酯（油酸甲酯）（41.372%）、亚麻酸甲酯（7.362%）、棕榈酸甲酯（11.430%）和硬脂酸甲酯（5.724%）；结合态脂肪酸的甲酯化物中共检测鉴定出15个化合物，占其色谱峰总面积的95.9%，不饱和脂肪酸占84.9%，主要成分为亚油酸甲酯（31.534%）、（Z）-9-十八碳烯酸甲酯（24.397%）、亚麻酸甲酯（28.877%）、棕榈酸甲酯（8.945%）；游离脂肪酸的甲酯化物中共检测鉴定出7个化合物，占其色谱峰总面积的85.3%，不饱和脂肪酸占31.4%，主要成分为棕榈酸甲酯（27.885%）、亚油酸甲酯（11.583%）、（Z）-9-十八碳烯酸甲酯（19.818%）、硬脂酸甲酯（17.977%）、芥酸甲酯（20.171%）。其中以结合态脂肪酸为主，占总脂肪酸的99%；不饱和脂肪酸占总脂肪酸的83.3%

图1 总脂肪酸甲酯的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of the methylated total fatty acids

表1 瓜蒌籽脂肪酸甲酯化成分及含量Table 1 Components and contents of the methylated fatty acids in the seed oil of T.ririlowii

图3 游离态脂肪酸甲酯的总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of the methylated free fatty acids

由此可知，瓜蒌籽油肪中，以不饱和脂肪酸亚油酸、油酸（9-十八碳烯酸）和亚麻酸为主，为富含结合态不饱和脂肪酸的植物油。与沈俊剑等[14]报道的瓜蒌籽脂肪酸成分的组成与含量有一定差异，可能是由于引种栽培、自然生境、提取方法等等因素导致的。

2.3 瓜蒌籽油抗氧化活性

自由基具有很强的化学性质，正常生物体内自由基处于稳衡动态[15]，一旦平衡被打破会产生多种自由基，自由基与衰老、癌症、心脑血管疾病及炎症的发生有密切的关系[16]。因此，瓜蒌籽油的自由基清除能力，将从一定角度反映其开发产品的保健功能。

2.3.1 DPPH自由基清除结果 DPPH自由基是一种稳定的自由基，通过测定其吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性[17]。从图4可知，瓜蒌籽油具有一定的清除DPPH自由基的能力，随着瓜蒌籽油浓度的增加，自由基清除率呈上升趋势，具有量效关系，当瓜蒌籽油浓度为100mg/mL时，清除率达80.2%，但其清除DPPH自由基的能力弱于对照样品（VC和橄榄油）。

图4 瓜蒌籽油DPPH自由基清除率Fig.4 Scavenging effects of seed oil of T.kirilowii on DPPH free radical

2.3.2 羟基自由基清除结果 羟基自由基在活性氧自由基中反应活性最强、毒性最大[18]。对羟自由基清除能力的测定是评价天然产物抗氧化活性的重要组成部分。从图5可知，随着瓜蒌籽油浓度的增加，清除羟基自由基的能力呈明显的上升趋势，当瓜蒌籽油浓度为1.0mg/mL时，清除率达95.0%。清除率达50%时，瓜蒌籽油、橄榄油、VC的质量浓度（ED50）分别0.12、0.14、0.09mg/mL，表明，瓜蒌籽油清除羟基自由基的能力强于橄榄油，稍弱于VC，表现出较强的抗氧化活性。

图5 瓜蒌籽油羟基自由基的清除率Fig.5 Scavenging effects of seed oil of T.kirilowii on ·OH radical

3 结论

通过对瓜蒌籽油提取率、脂肪酸存在的型态和抗氧化活性进行研究，发现瓜蒌籽富含油脂，脂肪酸以结合态为主，以亚油酸、油酸和亚麻酸为主要成分。同时，两种抗氧化活性测试结果均显示该种子油具有抗氧化活性。综上所述，瓜蒌籽是一种富含结合态不饱和脂肪酸的经济作物，且具有较好的自由基清除能力，应该在功能性食用油脂领域具有较好开发前景。

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Fatty acid composition and antioxidant activity of seed oil from Trichosanthes kirilowii

ZHAO Xiao-yun1，2，GUAN Zhong-hua2，LI Qi-ji2，WANG Dao-ping2，YANG Xiao-shengl，2，*
（1.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550002，China；2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，China）

The total fatty acids，bound and free fatty acids of seed oil from Trichosanthes kirilowii were identified by GC-MS technique together with method of methylation reaction，and the scavenging capacity of free radical were analyzed.The results showed that the seed of T.kirilowii was rich in fatty oil and its oil yield ration could reach 52%，the bound fatty acids（99%）were dominant component in the total fatty acids.Unsaturated fatty acids accounted for 83.3%，the main constituents were Linoleic acid，Oleic acid（9-Octadecenoic acid）and（Z，Z，Z）-9，12，15-Octadecenoic acid.The results of antioxidant activities showed that the seed oil had doeseffect relationship in scavenging activities of hydroxyl radical in vitro and the hydroxyl radical scavenging rate of 95.0%was observed at the concentration of 1.0mg/mL.In conclusion，the seed oil of T.kirilowii which was rich in unsaturated bound fatty acids should be a kind of functional edible oils for developing health foods.

Trichosanthes kirilowii；bound fatty acids；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2014）10-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.031

2013－12－19 *通讯联系人

赵小云（1989-），女，硕士研究生，研究方向：药物化学。

贵州省科技厅项目（黔科合人才团字（2013）4006）；黔科合重大专项（字[2013]6006号）。