基于生物技术控制大豆过敏原的研究进展

龚育清，杨安树，*，陈红兵，祖琴琴

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.南昌大学中德联合研究院，江西南昌330047）

大豆含有丰富的蛋白质，除蛋氨酸外，其余必需氨基酸的组成和比例与动物蛋白相似，是优质蛋白质的主要来源之一；同时，大豆还富含不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和其他营养成分，具有很高的营养价值。随着蛋白分离技术的不断发展，大豆蛋白制品的口感和食品功能性不断提高，大豆蛋白常作为配料广泛应用于各类食品中[1]。然而，大豆又是联合国粮农组织（FAO）认定的八大类过敏食品之一，因此，大豆在食品加工业中的广泛应用也给大豆过敏人群带来了潜在的危害[2-3]。迄今为止，国内外对大豆过敏尚无根治的办法，而对大豆过敏患者而言，要完全避免摄入含有大豆过敏原的食品几乎是不可能的。因此，弄清大豆中所含过敏原的种类和特性，并有针对性地采取相应的处理方法，使大豆中的过敏原失活、钝化，从而生产出低致敏性或无致敏性的大豆产品，保护大豆过敏患者的食用安全，具有非常重要的现实意义。目前用于蛋白脱敏的方法主要可以分为物理、化学和生物技术三大类，其中生物技术因其具有高效性、特异性、无污染等优点日渐成为人们关注的焦点，生物技术被广泛应用于低致敏性大豆及大豆制品的生产，是一种非常具有发展前景的制备低致敏大豆制品的方法。

1 大豆中主要过敏原

大豆过敏原蛋白为热稳定性因子，是大豆引发机体发生食物过敏反应的主要成分[4]。根据超速离心分析，用沉降系数S表示各组分，可将大豆过敏原蛋白分为15S、11S、7S和2S 4种球蛋白，11S球蛋白和7S球蛋白是大豆蛋白中的两种主要组成成分，约占大豆种子总蛋白的70%[5]，其中11S组分主要是大豆球蛋白，而7S组分主要是β-伴大豆球蛋白。根据不同的生物学功能，大豆蛋白过敏原可分为种子储藏蛋白、结构蛋白和防御相关蛋白3大类。其中，大豆种子储藏蛋白主要包括大豆球蛋白（11S球蛋白）、β-伴大豆球蛋白（7S球蛋白）以及7S球蛋白组分中的两个低丰度蛋白（Gly m Bd 28K和Gly m Bd 30K）；结构蛋白主要包括 Gly m 1（疏水蛋白）、Gly m 2（壳蛋白）、Gly m 3（抑制蛋白）等；防御相关蛋白主要包括病理相关蛋白、凝集素多肽片段、胰蛋白酶抑制剂等[6]。迄今为止，大豆种子储藏蛋白被认为是大豆过敏原蛋白中引发机体发生食物过敏反应的主要成分。

1.1 大豆球蛋白

大豆球蛋白（Glycinin，11S）是大豆中的一种主要贮藏蛋白，占种子总蛋白的19.5%～23.1%，具有大约3000个氨基酸残基，分子量为320～360ku[7]。大豆球蛋白是一种六聚体寡蛋白，每个单聚体亚基大多由一个酸性多肽链（A，分子量约为38ku）和一个碱性多肽链（B，分子量约为20ku）通过二硫键（S-S）连接形成A-S-S-B单体形式[8-9]。已发现的大豆球蛋白的酸性多肽链有6种：A1a、A1b、A2、A3、A4和A5；碱性多肽链有5种：B1a、B1b、B2、B3和B4。目前已分离得到的大豆球蛋白单聚体亚基有A1aB1b（G1，53.6ku）、A2B1a（G2，52.4ku）、A1bB2（G3，52.2ku）、A5A4B3（G4，61.2ku）和A3B4（G5，55.4ku）共5种[10]。大豆球蛋白的碱性多肽链的致敏性较弱，而其酸性多肽链与IgE、IgM、IgA有很强的结合活性，致敏性较强。

1.2 β-伴大豆球蛋白

伴大豆球蛋白（Conglycinin，7S）通过免疫电泳法分离、鉴定可分为α、β、γ 3种，其中，β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）是其主要存在形式，是大豆中的一种主要贮藏蛋白，占种子总蛋白的10%～12.7%，同时也是大豆中的主要过敏原[11]。β-伴大豆球蛋白是由α（约67ku）、α′（约71ku）和β（约50ku）3种亚基由疏水作用相互缔合而成的共轭型三聚糖蛋白[11]，其中，α亚基又称为Gly m Bd 60K，相对于α′亚基和β亚基，α亚基致敏性更强，它具有很强结合IgE、IgM和IgA的活性，能被25%的大豆过敏患者血清所识别[12]，部分品种的大豆还含有β′亚基。目前研究表明，β-伴大豆球蛋白有10种存在形式，其中已被鉴定出来有α3、α2α′、α2β、αα′β、αβ2、α′β2共6种，分别被称为B1-B6[7]。

1.3 Gly m Bd 28K

Gly m Bd 28K是大豆蛋白7S组分中的一种低丰度蛋白，由于它能被约25%的大豆过敏患者血清识别，因此被认为是大豆中的主要过敏原之一[13]。Gly m Bd 28K是一种以寡聚体形式存在的天冬酰胺糖蛋白，属于Cupin蛋白家族，糖基通过N-连接方式与Gly m Bd 28K蛋白上第20位的天冬酰胺残基连接[14]，单体含有240个氨基酸残基，分子质量为26ku。通过去糖基化作用，能使Gly m Bd 28K与大豆过敏患者血清中IgE特异性结合的活性丧失，说明糖基化位点是特异性IgE识别的重要表位[14]，可以推断N-连接聚糖部分是Gly m Bd 28K的IgE反应活性决定域。

1.4 Gly m Bd 30K

Gly m Bd 30K又称为P34，含量约为大豆蛋白总量的1%，是大豆蛋白7S组分中的一种低丰度蛋白，成熟的P34蛋白至少有10个抗原表位，能被65%的大豆过敏患者血清识别，因此，被认为是大豆中致敏性最强的过敏原，但也有研究认为大豆球蛋白的A3酸性多肽链是大豆中致敏性最强的过敏原[15]。P34是一种由257个氨基酸残基组成的不溶于水的单分子N-连接糖蛋白，多糖与蛋白的结合位点位于多肽链170位天冬酰胺处，属于木瓜蛋白酶超家族，但由于其活性中心的一个半胱氨酸被甘氨酸所取代，因而并不具有蛋白酶活性[16]。该蛋白还能通过二硫键与β-伴大豆球蛋白的α、α′以及β亚基等多肽结合，参与大豆蛋白的折叠。

2 生物脱敏技术

近年来，生物技术迅速发展并广泛应用于食品加工中，这不仅有利于促进各类功能性食品的开发，而且能够降低或消除食品中的有害物，保障消费者的食用安全。生物育种、酶法改性和微生物发酵等生物加工技术在低致敏性或无致敏性大豆及豆制品的开发中展示出了巨大的应用潜力。

2.1 生物育种

育种是指通过不同方法改良遗传特性或创造遗传变异培育出优良的动植物新品种的技术。育种的方式有多种，选择育种和杂交育种被认为是常规育种方式，而诱变育种、单倍体育种、多倍体育种、基因工程育种和细胞工程育种等统称为非常规育种，其中诱变育种常是利用物理、化学等因素诱发生物体遗传特性发生变异，通常不属于生物育种的范畴。生物育种在降低和消除大豆过敏原致敏性方面已经取得了一定成效，用于降低大豆致敏性的生物育种途径主要有常规育种法和非常规育种法中的基因工程技术育种。

2.1.1 常规育种 通过常规育种处理如筛选自然存在或发生变异的相应过敏原含量较少的大豆品种，或通过杂交手段可培育得到低致敏性的大豆。由于Gly m Bd 28K自然缺失型品种非常丰富，因而通过筛选很容易得到缺失过敏原Gly m Bd 28K的大豆品种[17]。由于不同品种的大豆致敏性不同，有文献报道[18]：通过筛选低致敏性大豆品种并对其进行杂交育种，培育出了β-伴球蛋白α亚基、α′亚基和β亚基的含量都很低的大豆品种Kari-kei 434。在日本野生大豆品种中发现的β-伴球蛋白的三个亚基都缺失的大豆品种“QT2”是在自然条件下产生的突变体，该品种表现出正常的农艺学性状，由于其具有极大的应用潜力和商业价值因而得到推广[19]。但是常规育种法的成功率较低，且周期较长，成本也较高。近年来，常规育种逐渐被非常规育种所代替。2.1.2 基因工程技术育种 基因工程技术育种在大豆脱敏中的应用主要是利用基因敲除技术将大豆中表达过敏原表位的基因去除，从而降低甚至消除其致敏性。如，Herman等[20]利用基因枪技术将30K的沉默载体pKS73转化入大豆体细胞中，成功地通过遗传修饰去除了大豆中主要过敏原Gly m Bd 30K，与对照植株相比，去除Gly m Bd 30K的转基因植株的生长性、蛋白含量以及含油率等农艺学性状没有显著的差异，且这种沉默性状能够稳定的遗传给下一代。

基因工程技术已经成为大豆育种的重要途径，然而它在降低大豆致敏性中的应用并不广泛，其主要原因是大豆中过敏原的种类非常多，在大豆总蛋白中占很高的比例，因此通过基因工程育种去除大豆中全部过敏原不太现实，并且可能会对大豆植株的生长特性以及大豆蛋白的加工性能产生不良影响[21]。另外，通过基因工程技术去除过敏原的方法本身就具有争议性，转基因大豆的生理毒性、营养吸收性以及对环境的威胁等仍有待进一步研究证实。

2.2 酶法改性

酶法改性降低大豆过敏原蛋白致敏性的方法主要包括酶水解和酶促交联，主要机制是利用蛋白酶催化过敏原蛋白发生水解或交联作用，改变蛋白质原有的空间结构，而蛋白质结构的变化，一方面通过改变过敏原的表位结构，对其致敏性产生影响；另一方面还可以改善蛋白质的功能特性，如凝胶特性、流变学特性、乳化性和保水性等。

2.2.1 酶水解 酶水解改性蛋白技术是利用一种或多种蛋白酶对蛋白进行内切及外切作用，将蛋白分子降解成肽类以及更小的氨基酸分子的方法，该方法具有反应条件温和、特异性高、无有害物质残留等优点。蛋白酶水解能使分子中部分化学键断裂改变过敏原表位原有的空间结构或水解酰胺键形成小分子肽段以减弱或消除大豆过敏原的致敏性。同时，蛋白酶水解还可以产生一些具有免疫调节、防癌、抗氧化、降血压等重要生理功能的生物活性肽[22-23]。

根据酶解程度和酶解产物分子量分布，可以将蛋白质酶解改性分为轻度酶解、适度酶解和深度酶解，而轻度酶解和适度酶解也被认为是限制性酶解。

2.2.1.1 限制性酶解 蛋白质的限制性酶解可实现水解度和酶解产物的多样性调控，不仅适用于低致敏性大豆蛋白产品的生产，而且常被用于生产具有特殊生理活性的多肽或优良加工特性的功能性蛋白。用于大豆蛋白限制性酶解的蛋白酶主要有作用于碱性氨基酸的胰蛋白酶、作用于疏水氨基酸的枯草杆菌中性蛋白酶、作用于亲水氨基酸的木瓜蛋白酶以及作用底物广泛的碱性蛋白酶，其中最常用的是木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶[24]。Shutov等[25]将木瓜蛋白酶和大豆球蛋白以质量比为1∶200的比例混合，30℃孵育，结果表明：木瓜蛋白酶能够很好的水解大豆球蛋白，而且酸性链水解和碱性链水解是分步进行的，酸性链的水解产物还可能对碱性链的水解起着促进作用。Tsumura等[26]发现一种芽孢杆菌碱性蛋白酶FG-F能有效水解大豆中β-伴大豆球蛋白的α亚基、Gly m Bd 30K和Gly m Bd 28K过敏原蛋白，从而降低大豆的致敏性，其中，Gly m Bd 30K与特异性IgE的免疫反应性降低高达99.2%。此外，Vernaza等[22]研究发现由地衣芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶能够有效的水解分子量大于40ku，包括β-伴大豆球蛋白α、α′和β亚基在内的过敏原蛋白。

2.2.1.2 深度酶解 蛋白质的深度酶解常用于低致敏性的酶解产物的生产，酶解产物主要是小分子肽和氨基酸，主要用作调味品和营养配方产品的原料。多种限制性蛋白酶的复合使用是深度酶解大豆过敏原蛋白非常有效的方法，有文献[27]报道利用AS1.398中性蛋白酶和木瓜蛋白酶（酶活比为1∶1）协同酶解大豆蛋白，就是一种深度酶解大豆过敏原蛋白，制取低分子肽的有效方法。Aguirre等[28]研究发现用乳酸杆菌CRL 251菌株的细胞悬液产生的酶水解大豆蛋白，可以几乎完全降解β-伴大豆球蛋白的3个亚基，大豆球蛋白的大部分酸性亚基和碱性亚基也被降解，水解产物中的小分子多肽、氨基酸特别是必需氨基酸含量大大提高。酶水解能够破坏大豆过敏原的某些过敏原表位，但同时，酶水解也可能使得某些隐藏在蛋白质空间结构内部和疏水区的线性过敏原表位暴露，形成新的过敏原表位，导致部分过敏患者食用此类食品后仍会出现过敏症状；而且，过度酶解因过多疏水基团的暴露使水解产物带有苦腥味，产品的适口性差，一定程度上制约了它在食品工业中的应用。针对酶深度水解容易产生苦味肽的缺陷，在蛋白水解方面常采用不同类型酶协同水解。研究发现利用碱性蛋白酶与氨肽酶协同水解能够切除苦味多肽末端的疏水氨基酸，因而能有效的去除大豆蛋白水解产物的苦味[29]；而利用酱油的Aspergillus属的霉曲产生的粗酶液浸泡豆腐，不仅可以降低豆腐的致敏性，同时此粗酶液中存在的外切蛋白酶能够降解苦味多肽，改善豆腐口感[30]。因此，大豆蛋白深度酶解后再结合利用能切除苦味多肽末端疏水氨基酸的限制性酶进行酶解，将有望为我们提供致敏性低并且口感适宜的大豆蛋白产品。

2.2.2 酶促交联 酶促交联作用能使过敏原蛋白内部多肽链之间或蛋白质分子之间形成共价键，促使蛋白质发生聚合，屏蔽暴露于蛋白质分子表面的过敏原表位，从而消除其致敏性。常用的交联酶主要有转谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶等，该方法已被应用于低致敏性花生和牛奶的研究和开发[31]。酶促交联对大豆过敏原蛋白致敏性影响的研究还处于起步阶段。如，Tang等[32]研究表明，转谷氨酰胺酶能有效地促使β-伴大豆球蛋白的主要组分以及大豆球蛋白中强致敏性的酸性多肽链发生交联，而对大豆球蛋白中致敏性较弱的碱性多肽链几乎不产生影响，但该研究对各蛋白发生交联的具体方式还没有深入的研究。过敏原交联后空间结构的改变能够屏蔽其分子表面原有的某些表位，但酶促交联形成蛋白质多聚体后，也有可能使其致敏性增强，因而酶促交联对大豆过敏原致敏性的影响仍有待进一步探索和评估。

2.2.3 酶复合改性 比较酶水解和酶促交联的作用机理，不难发现这两种酶法改性在降低大豆过敏原蛋白致敏性方面有一定的互补性。高致敏性的大豆蛋白经酶解后再进行酶促交联，一方面，酶解能有效的降低或消除大豆过敏原的致敏性；而酶促交联能掩盖和修饰相关过敏原表位，同时，还能保持或提高大豆蛋白的加工性能。研究发现大豆11S球蛋白经过SDL-9碱性蛋白酶水解后，再加入转谷氨酰胺酶使水解产物发生交联，能有效的提高其水溶性、乳化性和发泡性[33]。这种结合了酶水解-酶促交联优点的酶复合改性法将为低致敏性或无致敏性的大豆功能性产品的开发提供一条很好的途径。

2.3 微生物发酵

微生物发酵在大豆脱敏中的应用主要是利用发酵过程中微生物分泌的酶来降解大豆及豆制品中的过敏原或去除过敏原表位以降低其致敏性，同时还能够累积有益的代谢产物。

Feng等[34]研究发现豆粕经枯草芽孢杆菌发酵后，其中胰蛋白酶抑制剂的活性消失，而大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白几乎被完全降解，用这种发酵豆粕饲喂仔猪可显著改善仔猪的肠道消化功能，提高仔猪的生长性能。Teng等[35]分别用枯草芽孢杆菌和米曲霉接种于大豆粉进行固态发酵，结果表明：发酵不仅能够有效降低大豆粉的致敏性，而且能够提高其蛋白含量和抗氧化活性。也有研究发现：通过混菌发酵后的大豆粉因大豆蛋白的部分水解，使得β-伴大豆球蛋白的α亚基、α′亚基以及大豆球蛋白的酸性亚基的致敏性均有所降低[36]。Song等[37]发现大豆粉在自然条件下，以及分别接种植物乳杆菌、乳双歧杆菌、啤酒酵母发酵后能显著增加其总蛋白和氨基酸含量，并且与IgE的特异性免疫反应均能明显降低，其中，大豆粉经啤酒酵母发酵48h后与IgE免疫反应性降低高达89%。Lee等[38]将乳酸乳球菌、米曲霉和枯草芽孢杆菌接种于大豆进行联合发酵，检测显示：发酵产物几乎不与大豆过敏患者血清发生任何特异性免疫反应。上述研究表明：通过微生物发酵不仅能显著降低大豆制品的致敏性，同时还能改善产品的口感、提高其消化利用率和营养价值[39]。

3 展望

近年来，随着食物过敏患者人数不断上升，食物过敏已成为全世界普遍关注的食品安全问题。大豆作为一种重要的大众食品原料，同时又是主要的过敏食物，因此，开发低致敏或无致敏大豆及大豆制品具有重要的现实意义。由于大豆中的主要过敏原有很强的热稳定性，通过简单的热加工处理难以有效地降低其致敏性；而采用物理分离法去除过敏原也不能取得理想的效果，还会造成蛋白的损失和理化性质的改变；化学加工法虽然可以很大程度的除去大豆中某些过敏原，但会因引入化学试剂导致产品中化学物质的残留，带来食用安全隐患，而后期除去残留的化学物质又会增加加工成本；生物育种、酶法改性和微生物发酵等生物加工技术具有效率高、特异性好、无污染等优点，不仅能有效的降低或消除大豆中主要过敏原的致敏性，同时能改善大豆蛋白产品的某些功能特性，因此，生物技术在降低大豆致敏性方面的应用潜力巨大。然而，单一生物技术的应用常常很难使大豆过敏原的致敏性降低到安全范围内，产品的某些加工性能也难以满足食品加工的需要；此外，转基因大豆的食用安全性以及对环境的威胁也有待进一步研究证实。而多种生物技术以及生物技术与物理化学方法的联合使用有望为低致敏性或无致敏性的大豆功能性产品的开发提供一条很好的途径，将是未来研究和开发低致敏性或无致敏性大豆及豆制品的主要方向之一。

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